Un sistema di coltura organoide 3D ex vitro a lungo termine è stato stabilito da epatociti di topo. Questi organoidi possono essere passati e manipolati geneticamente dall'infezione da lentivirus di costruzione shRNA/ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Istituzione e manipolazione genetica degli organoidi epatociti murini
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il fegato è l'organo più grande nei mammiferi. Svolge un ruolo importante nella conservazione del glucosio, nella secrezione proteica, nel metabolismo e nella disintossicazione. Come esecutore per la maggior parte delle funzioni epatiche, gli epatociti primari hanno una capacità proliferante limitata. Ciò richiede l'istituzione di modelli di espansione epatocitaria ex vivo per la ricerca fisiologica e patologica epatica. Qui, abbiamo isolato gli epatociti murini mediante due fasi di perfusione di collagenasi e stabilito una coltura organoide 3D come "mini-fegato" per ricapitolare le interazioni cellula-cellula e le funzioni fisiche. Gli organoidi sono costituiti da popolazioni cellulari eterogenee tra cui progenitori ed epatociti maturi. Introduciamo il processo in dettaglio per isolare e coltivare gli epatociti murini o gli epatociti fetali per formare organoidi entro 2-3 settimane e mostriamo come passarli con il pipettaggio meccanico su e giù. Inoltre, introdurremo anche come digerire gli organoidi in singole cellule per l'infezione da lentivirus di costruzione shRNA / ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9. Gli organoidi possono essere utilizzati per schermi farmacologici, modelli di malattie e ricerca epatica di base modellando la biologia epatica e la patobiologia.
Introduzione
Gli organoidi sono cluster in vitro auto-organizzati, tridimensionali (3D) che includono cellule staminali auto-rinnovanti e cellule differenziate multi-linea1,2. Gli organoidi di molti organi sono stati stabiliti da cellule staminali pluripotenti o adulte da fattori di nicchia ben definiti tra cui l'intestino, il cervello, il colon, il rene, il fegato, il pancreas, la tiroide, lo stomaco, la pelle e il polmone3,4,5,6,7
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della School of Basic Medical Sciences dell'Università di Shandong e sono stati effettuati secondo la Licenza secondo le linee guida e i regolamenti del Ministero degli Interni (No. ECSBMSSDU2019-2-079).
NOTA: Questo protocollo viene utilizzato principalmente per la coltura di organoidi 3D da epatociti primari isolati.
1. Istituzione della coltura di epatociti murini
NOTA: La matrice extracellulare come Matrigel o BME viene utilizzata come matrice basale per la coltura di organoidi. Conserv....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Gli organoidi epatociti della femmina Alb-Cre; Il topo Rosa26-GFP (8 settimane) è stato osservato cinque giorni dopo la semina (Figura 1A). Gli organoidi proliferano con la colorazione positiva Ki67 (Figura 1B). L'espressione interferente di geni rappresentativi negli organoidi epatocitari mediante trasfezione di siRNA o infezione da lentivirus è stata esaminata mediante qRT-PCR e western blot. I risultati sono mostrati nelle Figure 2A
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La capacità di coltivare epatociti maturi per lunghi periodi è fondamentale nello studio della scienza di base del fegato, della tossicologia dei farmaci e delle infezioni epatotropiche di microbiologia dell'ospite come la malaria e i virus dell'epatite. Con una nicchia ben definita, il protocollo qui imposta un sistema di coltura per gli epatociti. Questo protocollo spinge gli epatociti maturi ad espandersi in coltura 3D con un'eterogeneità che ricapitola l'interazione cellula-cellula, la maggior parte delle funzioni ep.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non rivelano conflitti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il professor Hans Clevers per aver gentilmente fornito le linee cellulari per produrre R-spondin1 ricombinante. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), della National Natural Science Foundation of China (31970779) a H.H. e del Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group della Shandong University (2020QNQT003) a H.H.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3,50 g/L |
| Glucosio | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9,00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4,00 g/L |
| Na2HPO4· 12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4· 2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0,78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3,50 g/L |
| Fenolo Rosso | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0,06 g/L |
| Tampone per digestione | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0,50 M |
| Collagenasi IV | Sigma | C1639 | 0,10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23,80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4,00 g/L |
| Na2HPO4· 12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4· 2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0,78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3,50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | conservato a 4 gradi; C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | memorizzato a 4 gradi C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | conservato a 4 gradi; C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillina/streptomicina | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Concentrazione di stock 500 &; M, concentrazione finale 2 µ M |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | memorizzato a 4 gradi C |
| B-27 integratore 50x, meno vitamina A | Gibco | 1704-044 | 50 x |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Concentrazione stock 30 mM, concentrazione finale 3 &; M |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | conservato a 4 gradi; C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Concentrazione madre 100 mM, concentrazione finale 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | conservato a -20 gradi C |
| N-acetilcisteina | Sigma Aldrich | A9165 | Concentrazione madre 500 mM, concentrazione finale 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Concentrazione madre 1 M, concentrazione finale 3 mM |
| Penicillina/streptomicina | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| EGF umano ricombinante | Peprotech | AF-100-15 | Concentrazione di riserva 100 &; g/ml, concentrazione finale 50 ng/ml |
| FGF10 umano ricombinante | Peprotech | 100-26 | Concentrazione madre 100 µ g/ml, concentrazione finale 100 ng/ml |
| HGF umano ricombinante | Peprotech | 100-39 | Concentrazione madre 100 µ g/ml, concentrazione finale 25 ng/ml |
| TGF umano ricombinante-&alfa; | Peprotech | 100-16A | Concentrazione di stock 100 µ g/ml, concentrazione finale 100 ng/ml |
| TNF umano ricombinante-&alfa; | Origene | TP750007-1000 | Concentrazione stock 100 & micro; g/ml, concentrazione finale 100 ng/ml |
| Inibitore della Rho chinasi Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dicloridrato | Concentrazione madre 10 mM, concentrazione finale 10 µ |
| M Rspondina-1 terreno | Linea cellulare stabile generata nel laboratorio Hu. Concentrazione finale 15%. | ||
| Altri | |||
| 0,22 µ m filtro | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # tubo in silicone | LangerPump | ||
| 24 pozzetti, sospensione | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 ° C Bagnomaria | |||
| 70 &; m filtro | BD | 352350 | |
| Accutase | staminale | AT-104 | conservato a 4 gradi; C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Topo |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Coniglio |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Topo |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | |
| Coniglio Cabina di sicurezza biologica | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Soluzione di recupero cellulare | Corning | 354253 | conservato a 4 ° C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubatore | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | conservati presso RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | immagazzinato a -20 ° C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | conservato a -80 ° C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co., Ltd. | REVG004 | Aumento dell'efficienza dell'infezione virale |
| Software Image Pro Plus | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | versione 6.0 | |
| Reagente di trasfezione Lipofectamin RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Aumento dell'efficienza dell'infezione virale |
| Colorante per cellule vive | Luna | F23001 | conservato a 4 gradi; C |
| Centrifuga da tavolo a bassa velocità | TD5A-WS/TD5AWS | ||
| Nucleofactor-α 2b Dispositivo | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | conservato a 4 gradi; C |
| Pipetta Pasteur | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Pompa peristaltica | LangerPump | BT100-2J | |
| Membrana PVDF | Millipore | IPVH00010 | Attiva con metanolo |
| PX458 | Addgene | 48138 | conservato a -80 ° C |
| Centrifuga refrigerata | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Concentrazione stock 10 mM, concentrazione finale 4 &; M |
| Tripsina/EDTA | Gibico | 25200072 | conservato a 4 gradi; C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | immagazzinato a -20 gradi E |
Riferimenti
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D cultur....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
