Qui, presentiamo un protocollo di trapianto tumorale per la caratterizzazione di linfociti infiltrati tumorali intrinseci e periferici derivati dal tumore in un modello di tumore murino. Il tracciamento specifico dell'afflusso di cellule immunitarie derivate dal ricevente con citometria a flusso rivela la dinamica dei cambiamenti fenotipici e funzionali di queste cellule durante le risposte immunitarie antitumorali.
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Articolo metodologico
Trapianto di tumore per valutare la dinamica delle cellule T CD8+ infiltranti il tumore nei topi
In questo articolo
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Sommario
Abstract
L'immunità mediata dalle cellule T svolge un ruolo cruciale nelle risposte immunitarie contro i tumori, con i linfociti T citotossici (CTL) che svolgono un ruolo di primo piano nell'eradicazione delle cellule cancerose. Tuttavia, le origini e il rifornimento delle cellule T CD8+ specifiche dell'antigene tumorale all'interno del microambiente tumorale (TME) rimangono oscuri. Questo protocollo impiega la linea cellulare di melanoma B16F10-OVA, che esprime stabilmente il neoantigene surrogato, l'ovoalbumina (OVA) e i topi transgenici OT-I TCR, in cui oltre il 90% delle cellule T CD8 + riconosce specificamente il peptide OVAOVA 257-264 derivato (SIINFEKL) legato alla molecola del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I H2-Kb. Queste caratteristiche consentono lo studio delle risposte delle cellule T antigene-specifiche durante la tumorigenesi.
Combinando questo modello con la chirurgia del trapianto di tumore, i tessuti tumorali dei donatori sono stati trapiantati in topi riceventi singenici abbinati al tumore per tracciare con precisione l'afflusso di cellule immunitarie derivate dal ricevente nei tessuti dei donatori trapiantati, consentendo l'analisi delle risposte immunitarie del CD8+ antigene specifico intrinseco al tumore e alla periferia Cellule T. È stata riscontrata una transizione dinamica tra queste due popolazioni. Collettivamente, questo progetto sperimentale ha fornito un altro approccio per studiare con precisione le risposte immunitarie delle cellule T CD8 + nella TME, che getterà nuova luce sull'immunologia tumorale.
Introduzione
La risposta immunitaria mediata dalle cellule T CD8 + svolge un ruolo fondamentale nel controllo della crescita tumorale. Durante la tumorigenesi, le cellule T CD8+ naïve vengono attivate al momento del riconoscimento dell'antigene in modo limitato alla classe I MHC e successivamente si differenziano in cellule effettrici e si infiltrano nella massa tumorale 1,2. Tuttavia, all'interno del microambiente tumorale (TME), l'esposizione prolungata all'antigene, così come i fattori immunosoppressivi, guidano le cellule T CD8+ specifiche del tumore infiltrate in uno stato iporesponsiv....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dei comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali della Terza Università medica militare. Utilizzare topi C57BL/6 di 6-8 settimane e topi transgenici OT-I naïve del peso di 18-22 g. Usa sia maschio che femmina senza randomizzazione o "accecamento".
1. Preparazione del mezzo e dei reagenti
- Preparare il terreno di coltura cellulare D10 come descritto in precedenza29 aggiungendo il 10% di siero bovino fetale (FBS), 100 U / mL di penicillina, 100 mg / mL di streptomicina e 2 mM di L-glutammina nel Modified Eagle Mediu....
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Risultati
Lo schema di questo protocollo è mostrato nella Figura 1. Otto giorni dopo l'inoculazione tumorale, le cellule CD45.1+ e CD45.1+CD45.2+ OT-I sono state iniettate in topi C57BL/6 contenenti tumore B16F10-OVA. Il tumore è stato sezionato chirurgicamente da topi impiantati con cellule CD45.1+ OT-I (donatore) il giorno 8 post-trasferimento e trapiantato in topi impiantati con cellule OT-I CD45.1 + CD45.2 + abbinati al tumore (rice.......
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Discussione
L'immunità mediata dalle cellule T svolge un ruolo cruciale nelle risposte immunitarie contro i tumori, con le CTL che svolgono il ruolo principale nell'eradicazione delle cellule cancerose. Tuttavia, le origini delle CTL antigene tumorale specifiche all'interno della TME non sono state chiarite30. L'uso di questo protocollo di trapianto tumorale ha fornito un indizio importante sul fatto che le cellule T CD8+ specifiche dell'antigene intratumorale potrebbero non persistere a lungo, non.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (n. 31825011 a LY) e della National Natural Science Foundation of China (n. 31900643 a QH, n. 31900656 a ZW).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 μ m filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL siringa tubercolina | KDL | BB000925 | |
| 1,5 mL provetta da centrifuga | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U siringa da insulina | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL provetta conica | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoetanolo (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-metil-2-butanolo | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μ m filtro cellulare in nylon | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-topo CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA linea cellulare | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (albumina sierica bovina) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Topo Anti-Topo CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| piatto | per coltura cellulareBEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuga | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| ciclofosfamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ Kit di isolamento delle cellule T | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| Provette FACS | BD Falcon | 352052 | |
| siero fetale bovino | Gibco | 10270-106 | |
| citometro a flusso | BD | FACSCantometro II | |
| PorLab Scientific | HM330 | ||
| isoflurano | RWD scienze della vita | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| Kit di colorazione per cellule morte nel vicino infrarosso fissabile LIVE/DEAD, per eccitazione a 633 o 635 nm | Life Technologies | L10199 | |
| portaago | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldeide | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-topo TCR Vα 2 | BioLegend | 127808 | Clone: B20.1 |
| Pen Strep Glutammina (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-topo CD8a | BioLegend | 100734 | Clone: 53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| azoturo di sodio | Sigma | S2002 | |
| pinza chirurgica | RWD Life Science | F12005-10 | |
| forbici chirurgiche | RWD Life Science | S12003-09 | |
| filo di sutura | RWD Life Science | F34004-30 | |
| tripsina-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Riferimenti
- Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4),....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
