Il meccanismo associato alla fagocitosi nell'infezione da Leishmania rimane poco conosciuto. Qui, descriviamo i metodi per valutare gli eventi precoci che si verificano durante l'interazione di Leishmania con le cellule ospiti.
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Articolo metodologico
Studiare la fagocitosi della Leishmania usando la microscopia confocale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fagocitosi è un processo orchestrato che coinvolge fasi distinte: riconoscimento, legame e internalizzazione. I fagociti professionali assorbono i parassiti della Leishmania mediante fagocitosi, consistente nel riconoscere i ligandi sulle superfici dei parassiti da più recettori delle cellule ospiti. Il legame della Leishmania alle membrane dei macrofagi avviene attraverso il recettore del complemento di tipo 1 (CR1) e il recettore del complemento di tipo 3 (CR3) e i recettori di riconoscimento dei pattern. Il lipofosfoglicano (LPG) e la glicoproteina 63 kDa (gp63) sono i principali ligandi coinvolti nelle interazioni macrofago-Leishmania . Dopo il riconoscimento iniziale dei ligandi del parassita da parte dei recettori delle cellule ospiti, i parassiti si internalizzano, sopravvivono e si moltiplicano all'interno dei vacuoli parassitoforici. Il processo di maturazione dei vacuoli indotti da Leishmania comporta l'acquisizione di molecole da vescicole intracellulari, tra cui la proteina G monomerica Rab 5 e Rab 7, la proteina di membrana associata lisosomiale 1 (LAMP-1), la proteina di membrana associata lisosomiale 2 (LAMP-2) e la proteina 1A/1B-catena leggera 3 associata ai microtubuli (LC3).
Qui, descriviamo i metodi per valutare i primi eventi che si verificano durante l'interazione della Leishmania con le cellule ospiti usando la microscopia confocale, incluso (i) legame (ii) internalizzazione e (iii) maturazione dei fagosomi. Aggiungendo al corpo di conoscenze che circondano questi determinanti dell'esito dell'infezione, speriamo di migliorare la comprensione della patogenesi dell'infezione da Leishmania e sostenere l'eventuale ricerca di nuovi bersagli chemioterapici.
Introduzione
La leishmaniosi è una malattia tropicale trascurata causata da protozoi parassiti del genere Leishmania, che provoca un ampio spettro di manifestazioni cliniche nell'ospite vertebrato, tra cui la leishmaniosi cutanea, la leishmaniosi mucocutanea e la leishmaniosi viscerale1. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) stima che oltre un miliardo di persone siano a rischio, con oltre un milione di nuovi casi segnalati ogni anno2.
Leishmania spp. sono protozoi intracellulari obbligati che sopravvivono all'interno delle cellule ospiti, inclusi monociti, macrofagi e cellule dend....
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Protocollo
Le cellule sono state ottenute da donatori sani a seguito dell'approvazione delle procedure da parte dei comitati etici nazionali di ricerca (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Colture cellulari
- Macrofagi derivati da monociti umani
NOTA: Per ottenere macrofagi derivati da monociti umani per la differenziazione in vitro in macrofagi, raccogliere sangue da donatori sani e purificare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) come descritto da D. English e B. R. Andersen21.- Dopo aver raccolto il sangue periferico (50 ml), versarlo in un tubo eparinizzato e quindi diluire il sangue 1:1 i....
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Risultati
Questo rapporto si propone di valutare gli eventi precoci che si verificano durante la fagocitosi di L. braziliensis isolati da pazienti che presentano forma di CL L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL. Utilizzando la microscopia confocale, abbiamo studiato i principali eventi associati alla fagocitosi dei parassiti: legame, internalizzazione e maturazione dei fagosomi. Per prima cosa abbiamo valutato il legame e la fagocitosi di L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL mediante ma.......
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Discussione
L'interazione Leishmania-macrofagi è un processo complesso e comporta diversi passaggi che possono influenzare lo sviluppo della malattia5. Per comprendere meglio i meccanismi coinvolti nell'interazione tra Leishmania non opisonizzata e cellule ospiti, abbiamo descritto un protocollo che impiega la microscopia a fluorescenza confocale per valutare la fagocitosi dalle fasi iniziali a quelle tardive dell'infezione da Leishmania. L'uso di tecniche di fluorescenza che coinvo.......
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Dichiarazioni
I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta o analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto. Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Ringraziamo l'Istituto Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahia, Brasile e il dipartimento di microscopia per l'assistenza. Questo lavoro è stato supportato dal numero 79700287000 di INOVA-FIOCRUZ, P.S.T.V. detiene una sovvenzione per la produttività nella ricerca da CNPq (305235 / 2019-2). I plasmidi sono stati gentilmente forniti da Mauricio Terebiznik, Università di Toronto, CA. Gli autori desiderano ringraziare Andris K. Walter per la revisione in lingua inglese e l'assistenza per il copyediting del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoetanolo | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-coniugato capra anti-coniglio IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anticorpo anti-LC3 | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Rosso (CMTPX) Colorante | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrí Thermo | Fisher Scientific Incubatore | ||
| CO2 Ciprofloxacina | Isofarma | X | |
| Thermo Fisher Scientific | X | ||
| Microscopio a fluorescenza confocale (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | ||
| (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicina | Gibco | 15750045 | |
| Glutammina | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (Acido N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etano-solfonico) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Siero di capra normale | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Dispositivo | Lonza | AAB-1001 | |
| Soluzione di nucleofector | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldeide | Sigma | 158127 | |
| Falloidina | Invitrogen | A12379 | |
| Acetato di miristato di forbolo (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Soluzione tampone fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | ||
| ProLong Gold | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponina | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Insetto di Schneider medio | Sigma | S0146 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S5761 | |
| Piruvato di sodio | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Riferimenti
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1(201....
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Ristampe e permessi
