Articolo metodologico

Un test di neutralizzazione rapido e multiplex Dual Reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 per un sistema di analisi del flusso basato su perle multiplexate

DOI:

10.3791/62487

⸱

6 aprile 2021

 ,  ,  , 
1Luminex Corporation, 2Departments of Pathology and Laboratory Medicine, Clinical Microbiology, University of Rochester Medical Center, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un sistema di analisi di flusso per saggi multiplexati basati su perle che fornisce una lettura a due reporter è stato utilizzato per lo sviluppo di saggi sierologici multiplex e di neutralizzazione degli anticorpi in grado di misurare contemporaneamente gli anticorpi IgG e IgM neutralizzanti per SARS-CoV-2.

Abstract

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La pandemia di COVID-19 ha sottolineato la necessità di metodi rapidi ad alto rendimento per il rilevamento sierologico sensibile e specifico dell'infezione da nuovi agenti patogeni, come SARS-CoV-2. Il test sierologico multiplex può essere particolarmente utile perché può analizzare contemporaneamente gli anticorpi contro più antigeni che ottimizzano la copertura dei patogeni e controlla la variabilità nell'organismo e la risposta individuale dell'ospite. Qui descriviamo un test basato su microsfera fluorescente SARS-CoV-2 IgG 3-plex in grado di rilevare sia gli anticorpi IgM che IgG a tre principali antigeni SARS-CoV-2: la proteina spike (S), il dominio di legame del recettore (RBD) dell'enzima di conversione dell'angiotensina spike (ACE2) e il nucleocapside (Nc). Il test ha dimostrato di avere prestazioni comparabili a un test di riferimento SARS-CoV-2 per IgG nel siero ottenuto a ≥21 giorni dall'insorgenza dei sintomi, ma aveva una maggiore sensibilità con campioni raccolti a ≤5 giorni dall'insorgenza dei sintomi. Inoltre, utilizzando ACE2 solubile in un formato di test di neutralizzazione, è stata dimostrata l'inibizione del legame anticorpale per S e RBD.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La pandemia di COVID-19 ha sottolineato l'importanza di essere in grado di sviluppare e implementare rapidamente test sierologici rapidi, ad alto rendimento e ad alte prestazioni che possono essere utilizzati per la diagnosi e la sorveglianza di nuovi agenti patogeni come SARS-CoV-2. I test sierologici multiplex possono essere estremamente utili in una pandemia, in quanto possono analizzare contemporaneamente gli anticorpi contro più antigeni, il che fornisce un'ampia copertura patogena e controlli per la variabilità nell'organismo e la risposta dell'ospite all'infezione. Lo sviluppo di un test multiplo basato su perle fluorescenti, il SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), in grado di rilevare anticorpi contro la proteina spike (S), il dominio di legame del recettore (RBD) dell'enzima di conversione dell'angiotensina spike (ACE2) e il nucleocapside (Nc) di SARS-CoV-2 è stato recentemente riportato1. 3Flex ha dimostrato di avere prestazioni comparabili a un test di riferimento SARS-CoV-2 IgG per siero ottenuto a ≥21 giorni dall'insorgenza dei sintomi, ma ha avuto una sensibilità più elevata con campioni raccolti a ≤5 giorni dall'insorgenza dei sintomi. Inoltre, è stata dimostrata l'inibizione del legame anticorpale per gli antigeni S e RBD utilizzando ACE2 solubile in un formato di test di neutralizzazione. La tecnologia basata su perle multiplex è stata ampiamente adottata come tecnologia collaudata per i test sierologici multiplex e presenta vantaggi distinti per lo screening su larga scala, tra cui tempi brevi per i risultati, requisiti di piccoli campioni e manodopera ridotta2,3,4.

Recentemente, è diventato disponibile un nuovo strumento di analisi del flusso che fornisce la stessa capacità high-plex e ad alto throughput del sistema dimostrata nel precedente lavoro1, ma con l'ulteriore vantaggio di due canali reporter. La capacità di misurare due segnali reporter fluorescenti in una singola reazione consente la valutazione di due risultati per analita per ciascun campione ed è ideale per applicazioni di isotipizzazione, che in genere devono essere eseguite in pozzetti di reazione separati5. La capacità dual reporter fornisce il doppio dei dati per ciascun campione nella metà dei pozzi di reazione con la metà dei requisiti di volume del campione, e quindi ha un chiaro vantaggio rispetto ai sistemi a singolo reporter. Questo studio descrive in dettaglio il protocollo di test sierologico standard e descrive l'adattamento a un test di neutralizzazione. Inoltre, questo rapporto descrive la conversione del test del singolo reporter in un test sierologico a doppio reporter e, successivamente, un test di neutralizzazione del doppio reporter, per misurare simultaneamente gli anticorpi neutralizzanti degli isotipi IgG e IgM contro gli antigeni SARS-CoV-2 S, RBD e Nc. Una panoramica visiva del protocollo di analisi è fornita nella Figura 1.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Campioni di siero umano residuo precedentemente testati per le analisi diagnostiche SARS-CoV-2 sono stati utilizzati in questo studio che è stato approvato dall'Università di Rochester Institutional Review Board.

1. Reagenti e attrezzature

  1. Ottenere antigeni di coronavirus e IgG e IgM umani da fonti commerciali.
  2. Ottenere set di perle di controllo del saggio (AC) (45 e 220) dal fornitore dello strumento. Il set di perle AC 45 monitora la raccolta di intensità di fluorescenza mediana (MFI) su strumenti a canale singolo reporter (RP1). Il set di peri AC 220 monitor la raccolta MFI sul secondo canale reporter (RP2).
  3. Ottenere anticorpi di rilevamento e sieri di coniglio antigene-specifici e anticorpi utilizzati per la conferma dell'accoppiamento.
  4. Eseguire il rilevamento con anticorpi etichettati con biotina con streptavicina, coniugato R-ficoeritrina (SAPE) o coniugato streptavicina di fluoroforo Super Bright 436 (SASB; eccitazione a 405 nanometri (nm) ed emissione a 436 nm).
  5. Ottenere la proteina ACE2 umana (cioè il recettore SARS). Prima dell'uso, reidratare la proteina ACE2 liofilizzata sciogliendo in concentrazione di 1 mg/mL in acqua priva di nucleasi (non trattata con DEPC, autoclavata e filtrata sterile da 0,2 μm) e conservare a 4 °C.
  6. Eseguire tutte le reazioni in piastre a fondo piatto nero NBS (non lebinding surface) a 96 pozzi. Sigillare le piastre con nastro sigillante in alluminio micropiastra a 96 pozzi per le fasi di incubazione del saggio. Utilizzare un separatore magnetico a piastre per le fasi di lavaggio del saggio.

2. Preparazione di peri di controllo accoppiate ad antigene e ad anticorpi

  1. Accoppiano covalentemente insiemi di microsfere magnetiche, polistirene e codificate a colori (diametro 6,5 μm) con antigeni S, RBD e Nc come descritto in Cameron et al.1. Gli antigeni del coronavirus sono accoppiati a 10 pmol/106 perle (S) e 100 pmol/106 perle (RBD e Nc). Le pere di controllo accoppiate con IgG o IgM umane vengono generate come descritto in precedenza1. IgG e IgM sono accoppiati a 5 μg/106 perli.
  2. Dopo l'accoppiamento, determinare le concentrazioni di perle e diluire ciascun ceppo a 1 x10 6 perle/mL utilizzando le procedure descritte6.
  3. Eseguire la conferma dell'accoppiamento dell'antigene con anticorpi antigene-specifici dal coniglio o con sieri umani positivi come descritto in Cameron et al.1.
    1. Confermare l'accoppiamento IgG umano con i reagenti di rilevamento IgG/SAPE anti-umani biotinilati del test e l'accoppiamento IgM con una IgM anti-umana di capra etichettata con ficoeritrina (PE).
      NOTA: la conferma dell'accoppiamento viene eseguita utilizzando una titolazione di siero o anticorpo proteico-specifico, poiché la concentrazione ottimale da utilizzare per questi reagenti non è nota. Per il siero vengono utilizzate diluizioni seriali a piega mentre per gli anticorpi forniti come scorte mg/mL vengono utilizzate serie di diluizione seriale μg/mL.
  4. Perle di controllo del saggio diluito (AC) che monitorano la raccolta di IFM nei due canali reporter a una concentrazione di 1 x 106 perle / mL prima dell'uso in miscele di perle multiplex.

3. Preparazione della miscela di perle multiplex fresche

  1. Preparare miscele di perle multiplex appena ogni giorno dalle singole perle accoppiate e controllare le scorte di perle a 1 x 106 perle / ml.
    NOTA: le miscele multiple di perle sono preparate per fornire 2.500 perle per ogni regione di perle in un volume di 50 μL. I calcoli su come preparare miscele di perle multiplex per qualsiasi numero di reazioni sono descritti nel blog pubblicato da Angeloni (2020)6.

4. Diluizione del campione

  1. Preparare una diluizione del campione di siero 1:100 mescolando 10 μL di siero in 990 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente lo 0,05% di Tween 20, lo 0,02% di sodio azide e l'1% di albumina sierica bovina (BSA) (tampone PBS-TBN).
  2. Diluire nuovamente i campioni 10 volte aggiungendo 20 μL della diluizione 1:100 a 180 μL di PBS-TBN.
    NOTA: i campioni di siero sono costituiti da sieri negativi, da campioni raccolti nel 2019 prima della pandemia di COVID-19, e sieri positivi da pazienti SARS-CoV-2 PCR-positivi, che rappresentano titoli anticorpali bassi e alti. I campioni positivi sono stati raccolti tra ≈3 e >60 giorni dall'insorgenza dei sintomi (DFSO). Tutti i campioni di siero e i sieri di controllo negativi spogliati con IgG sono diluiti a 1:1000 come descritto di seguito. Per i saggi di neutralizzazione, i sieri sono diluiti 1:500 come descritto nei protocolli di neutralizzazione di seguito (paragrafi 6 e 8).

5. Protocollo di analisi sierologica a singolo reporter

  1. Aggiungere 50 μL di miscela di perle multiplex a ciascun pozzo assegnato di una piastra di microtitolatore non vincolante a 96 pozzetti.
  2. Pipetta 50 μL di siero 1:1000 o PBS-TBN nei pozzi appropriati; la diluizione finale del siero nel pozzo è 1:2000.
  3. Coprire la piastra con un sigillo in lamina micropiastra e incubare su uno shaker a piastre riscaldate a 37 °C per 15 minuti con agitazione a 600 giri/min.
  4. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sul separatore magnetico per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
  5. Mentre si trattiene la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
  6. Tamponare la piastra su carta assorbente mentre si tiene ancora la piastra sul magnete.
  7. Lavare i pozzi di reazione come descritto di seguito (primo lavaggio di incubazione post-campione).
    1. Rimuovere la piastra dal magnete della piastra e aggiungere 150 μL di PBS-TBN a ciascun pozzo.
    2. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio fresco e agitare a 37 °C per 2 minuti a 600 giri/min.
    3. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sulla piastra magnetica per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
    4. Mentre si trattiene la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
    5. Tamponare la piastra su carta assorbente mentre si tiene ancora la piastra sul magnete.
  8. Lavare i pozzi di reazione come descritto di seguito (secondo lavaggio di incubazione post-campione).
    1. Rimuovere la piastra dal magnete della piastra e aggiungere 150 μL di PBS-TBN a ciascun pozzo.
    2. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio fresco e agitare a 37 °C per 2 minuti a 600 giri/min.
    3. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sulla piastra magnetica per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
    4. Mentre si trattiene la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
    5. Rimuovere la piastra dal magnete.
  9. Fare una nuova miscela di biotina-anti-umana IgG con SAPE diluendo l'anticorpo a 0,62 μg/mL e il SAPE a 1 μg/mL. Aggiungere 100 μL a ciascun pozzo.
  10. Coprire la piastra con un sigillo in lamina micropiastra e incubare su uno shaker a piastre riscaldate a 37 °C per 15 minuti con agitazione a 600 giri/min.
  11. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sul separatore magnetico per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
  12. Mentre si trattiene la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
  13. Tamponare la piastra su carta assorbente mentre si tiene ancora la piastra sul magnete.
  14. Lavare i pozzi di reazione come descritto di seguito (primo lavaggio di incubazione degli anticorpi post-rilevamento).
    1. Rimuovere la piastra dal magnete della piastra e aggiungere 150 μL di PBS-TBN a ciascun pozzo.
    2. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio fresco e agitare a 37 °C per 2 minuti a 600 giri/min.
    3. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sulla piastra magnetica per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
    4. Mentre si trattiene la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
    5. Tamponare la piastra su carta assorbente mentre si tiene ancora la piastra sul magnete.
  15. Lavare i pozzi di reazione come descritto di seguito (secondo lavaggio di incubazione degli anticorpi post-rilevamento).
    1. Rimuovere la piastra dal magnete della piastra e aggiungere 150 μL di PBS-TBN a ciascun pozzo.
    2. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio fresco e agitare a 37 °C per 2 minuti a 600 giri/min.
    3. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sul separatore magnetico per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
    4. Mentre si trattiene la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
    5. Rimuovere la piastra dal magnete.
  16. Aggiungere 100 μL di PBS-TBN a ciascun pozzo.
  17. Coprire con un sigillo di alluminio e agitare per 2 minuti a 37 °C.
  18. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra. Quindi rimuovere la guarnizione della lamina e leggere 50 μL di ciascun pozzo sull'analizzatore di flusso secondo il manuale dell'utente. Di seguito è riportata una breve descrizione.
    1. Selezionare il menu a discesa nell'angolo in alto a sinistra dello schermo e passare a Configurazione piastra.
    2. Selezionare Esegui piastra.
    3. Selezionare l'icona Espelli per espellere il supporto della piastra.
    4. Caricare la piastra sul portapiasle e selezionare l'icona Retract per ritrarre il portapiasle.
    5. Selezionare l'icona Esegui per eseguire la piastra.

6. Protocollo di test di neutralizzazione del singolo reporter

  1. Preparare una miscela di perle multiplex fresche come descritto nella sezione 3 di cui sopra.
  2. Diluire il paziente e controllare sera 1:500 come segue.
    1. Siero diluito 1:100 mescolando 10 μL di siero in 990 μL di PBS-TBN.
    2. Diluire il siero di ulteriori 5 volte aggiungendo 40 μL di siero 1:100 in 160 μL di PBS-TBN.
  3. Aggiungere 50 μL di miscela di perle multiplex a ciascun pozzo assegnato di una piastra di microtitolatore non vincolante a 96 pozzetti.
  4. Aggiungere 25 μL di diluizione ACE2 da 2 μg/mL a ciascun pozzo.
  5. Coprire la piastra con un sigillo in lamina micropiastra e incubare su uno shaker a piastre riscaldate a 37 °C per 2 minuti con agitazione a 600 giri/min.
  6. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e rimuovere il sigillo della lamina.
  7. Aggiungere 25 μL di siero 1:500 o PBS-TBN ai pozzi assegnati.
  8. Coprire la piastra con un sigillo in lamina micropiastra e incubare su uno shaker a piastre riscaldate a 37 °C per 15 minuti con agitazione a 600 giri/min.
  9. Per il resto della procedura di analisi, seguire i passaggi da 5.4 a 5.18.5 come descritto sopra.

7. Conversione in un test sierologico IgG e IgM a doppio reporter

  1. Preparare pere accoppiate all'antigene come descritto nella sezione 2 di cui sopra.
    NOTA: un set di perle aggiuntivo, abbinato a IgM umane, è incluso per monitorare l'aggiunta di reagenti di rilevamento anti-IgM, nonché un set di perle CA aggiuntivo (220) per monitorare la raccolta di IFM per RP2. Tutti gli stock di perle sono a 1 x 106 perle / mL per l'inclusione in miscele di perle multiplex come descritto di seguito.
  2. Preparare miscele di perle multiplex fresche come descritto nella sezione 3 di cui sopra.
  3. Campioni di siero diluito e sieri di controllo negativi spogliati con IgG 1:1000 come descritto nel paragrafo 4 precedente.
  4. Aggiungere 50 μL di miscela di perle multiplex a ciascun pozzo assegnato di una piastra di microtitolatore non vincolante a 96 pozzetti.
  5. Pipetta 50 μL di siero 1:1000 o PBS-TBN ai pozzi appropriati. La diluizione finale del siero nel pozzo è 1:2000.
  6. Coprire la piastra con un sigillo in lamina micropiastra e incubare su uno shaker a piastre riscaldate a 37 °C per 15 minuti con agitazione a 600 giri/min.
  7. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sul separatore magnetico per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
  8. Mentre si trattiene la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
  9. Tamponare la piastra su carta assorbente mentre si tiene ancora la piastra sul magnete.
  10. Lavare i pozzi di reazione come descritto di seguito (primo lavaggio di incubazione post-campione).
    1. Rimuovere la piastra dal magnete della piastra e aggiungere 150 μL di PBS-TBN a ciascun pozzo.
    2. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio fresco e agitare a 37 °C per 2 minuti a 600 giri/min.
    3. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sulla piastra magnetica per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
    4. Mentre si trattiene la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
    5. Tamponare la piastra su carta assorbente mentre si tiene ancora la piastra sul magnete.
  11. Lavare nuovamente i pozzi di reazione con PBS-TBN (secondo lavaggio di incubazione post-campione), esattamente come descritto sopra nei passaggi 7.10.1-7.10.5.
  12. Rimuovere la piastra dal magnete.
  13. Creare una nuova miscela di reagenti di rilevamento con la combinazione richiesta di reagenti e aggiungere 50 μL o 100 μL a ciascun pozzerò.
    NOTA: Le miscele di reagenti di rilevamento contenenti le IgG anti-umane coniugate al colorante reporter Brilliant Violet 421 (BV; eccitazione a 405 nm ed emissione a 421 nm) sono state utilizzate a 50 μL / pozzo a causa delle quantità limitanti dei reagenti di riserva disponibili. Tutte le altre miscele di reagenti di rilevamento sono utilizzate a 100 μL / pozzo.
  14. Coprire la piastra con un sigillo in lamina micropiastra e incubare su uno shaker a piastre riscaldate a 37 °C per 15 minuti con agitazione a 600 giri/min.
  15. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sul separatore magnetico per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
  16. Mentre si trattiene la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
  17. Tamponare la piastra su carta assorbente mentre si tiene ancora la piastra sul magnete.
  18. Lavare i pozzi di reazione come descritto di seguito con PBS-TBN (primo lavaggio dopo l'incubazione degli anticorpi di rilevamento).
    1. Rimuovere la piastra dal magnete della piastra e aggiungere 150 μL di PBS-TBN a ciascun pozzo.
    2. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio fresco e agitare a 37 °C per 2 minuti a 600 giri/min.
    3. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sul separatore magnetico per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
    4. Mentre si trattiene la piastra sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
    5. Tamponare la piastra su carta assorbente mentre si tiene ancora la piastra sul magnete.
  19. Lavare nuovamente i pozzi di reazione con PBS-TBN (secondo lavaggio dopo l'incubazione degli anticorpi di rilevamento), esattamente come descritto sopra nei passaggi 7.17.1-7.17.5.
  20. Rimuovere la piastra dal magnete.
  21. Aggiungere 100 μL di PBS-TBN a ciascun pozzo.
  22. Coprire con un sigillo di alluminio e agitare per 2 minuti a 37 °C.
  23. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra. Quindi rimuovere il sigillo della lamina e leggere 50 μL di ciascun pozzo sull'analizzatore di flusso come descritto sopra nei passaggi 5.18.1-5.18-5.

8. Conversione al test di neutralizzazione del doppio reporter

  1. Utilizzare le pere accoppiate come descritto nel passaggio 7.1 precedente.
  2. Preparare una miscela di perle multiplex fresche come descritto al passaggio 7.2.
  3. I campioni di siero e i sieri di controllo negativi spogliati di IgG vengono diluiti 1:500 come segue.
    1. Preparare una diluizione 1:100 mescolando 10 μL di siero in 990 μL di PBS-TBN.
    2. Diluire ulteriormente 5 volte i campioni 1:100 aggiungendo 40 μL delle diluizioni 1:100 a 160 μL di PBS-TBN.
  4. Aggiungere 50 μL di miscela di perle multiplex a ciascun pozzo assegnato di una piastra di microtitolatore non vincolante a 96 pozzetti.
  5. Aggiungere 25 μL di diluizione ACE2 da 2 μg/mL a ciascun pozzo.
  6. Coprire la piastra con un sigillo in lamina micropiastra e incubare su uno shaker a piastre riscaldate a 37 °C per 2 minuti con agitazione a 600 giri/min.
  7. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e rimuovere il sigillo della lamina.
  8. Aggiungere 25 μL di siero 1:500 o PBS-TBN ai pozzi assegnati.
  9. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio e incubare su uno shaker a piastre riscaldate a 37 °C per 15 minuti con agitazione a 600 giri/min.
  10. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sul separatore magnetico per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
  11. Con la piastra trattenuta sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
  12. Tamponare la piastra su carta assorbente mentre si tiene ancora la piastra sul magnete.
  13. Lavare i pozzi di reazione come descritto di seguito (primo lavaggio post incubazione del campione).
    1. Rimuovere la piastra dal magnete della piastra e aggiungere 150 μL di PBS-TBN a ciascun pozzo.
    2. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio fresco e agitare a 37 °C per 2 minuti a 600 giri/min.
    3. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sul separatore magnetico per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
    4. Con la piastra trattenuta sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
    5. Tamponare la piastra su carta assorbente mentre si tiene ancora la piastra sul magnete.
  14. Lavare nuovamente i pozzi di reazione con PBS-TBN (secondo lavaggio di incubazione post-campione), esattamente come descritto sopra nei passaggi 8.13.1-8.13.5.
  15. Rimuovere la piastra dal magnete.
  16. Creare una nuova miscela di reagenti di rilevamento con la combinazione richiesta di reagenti e aggiungere 50 μL o 100 μL a ciascun pozzerò.
    NOTA: Le miscele di reagenti di rilevamento contenenti le IgG anti-umane coniugate al colorante reporter BV sono state utilizzate a 50 μL / pozzo a causa delle quantità limite dei reagenti di riserva disponibili (vedere Tabella dei materiali). Tutte le altre miscele di reagenti di rilevamento sono utilizzate a 100 μL / pozzo.
  17. Coprire la piastra con un sigillo in lamina micropiastra e incubare su uno shaker a piastre riscaldate a 37 °C per 15 minuti con agitazione a 600 giri/min.
  18. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sul separatore magnetico per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
  19. Con la piastra trattenuta sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
  20. Tamponare la piastra su carta assorbente mentre si tiene ancora la piastra sul magnete.
  21. Lavare i pozzi di reazione come descritto di seguito (il primo è stato dopo l'incubazione degli anticorpi di rilevamento).
    1. Rimuovere la piastra dal magnete della piastra e aggiungere 150 μL di PBS-TBN a ciascun pozzo.
    2. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio fresco e agitare a 37 °C per 2 minuti a 600 giri/min.
    3. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sul separatore magnetico per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
    4. Con la piastra trattenuta sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
    5. Tamponare la piastra su carta assorbente mentre si tiene ancora la piastra sul magnete.
  22. Lavare nuovamente i pozzi di reazione con PBS-TBN (secondo lavaggio dopo l'incubazione degli anticorpi di rilevamento), esattamente come descritto sopra nei passaggi 8.21.1-8.21.5.
    1. Rimuovere la piastra dal magnete della piastra e aggiungere 150 μL di PBS-TBN a ciascun pozzo.
    2. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio fresco e agitare a 37 °C per 2 minuti a 600 giri/min.
    3. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra e posizionare sul separatore magnetico per 2 minuti per separare le perle dalla miscela di reazione.
    4. Con la piastra trattenuta sul magnete, rimuovere il sigillo di alluminio, capovolgere con cura la piastra su un contenitore per rifiuti e far scorrere delicatamente il surnatante fuori dai pozzetti.
    5. Rimuovere la piastra dal magnete.
  23. Aggiungere 100 μL di PBS-TBN a ciascun pozzo.
  24. Coprire con un sigillo di alluminio e agitare per 2 minuti a 37 °C.
  25. Rimuovere la piastra dallo shaker della piastra. Quindi rimuovere il sigillo della lamina e leggere 50 μL di ciascun pozzo sull'analizzatore di flusso come descritto sopra nei passaggi 5.18.1-5.18-5.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ottimizzazione del Test Sierologico Single Reporter.
La strategia di accoppiamento per tutti gli antigeni SARS-CoV-2 è descritta in Cameron, et al., 20201 e nel passaggio 2.1 sopra. La strategia per la conferma dell'accoppiamento è descritta nel passaggio 2.3 precedente. Per un accoppiamento efficiente, i valori mediani di intensità di fluorescenza (IFM) devono essere significativamente superiori alle reazioni di controllo negative senza siero/senza anticorpi e devono dimostrare una risposta alla dose di segnale MFI decrescente con quantità decrescenti di reagente di rilevazione. Le IFM di circa 1.000 unità MFI o superiori rispetto alle IFM di fondo indicano generalmente un accoppiamento proteico efficiente e dipendono dalla concentrazione e dalla specificità del reagente di rilevazione utilizzato. Utilizzando questo metodo, la conferma dell'accoppiamento dell'antigene S, RBD e Nc è stata testata per due lotti di perle (Figura 2). I segnali MFI per tutti gli antigeni erano significativamente più alti dell'IFM di fondo e mostravano una risposta alla dose con titolazione dei reagenti di rilevazione. I dati hanno anche mostrato una buona riproducibilità dei livelli di IFM tra i due diversi lotti di perle accoppiate.

L'ottimizzazione del test del singolo reporter è stata eseguita come descritto in Cameron, et al., 20201. Ogni antigene è stato testato a diverse concentrazioni di accoppiamento con diverse diluizioni di diversi campioni di siero che rappresentano campioni alti, medi, bassi e negativi. Inoltre, poiché il test misura i titoli IgG, un siero spogliato di IgG è stato utilizzato come ulteriore campione negativo. I risultati di una serie rappresentativa di diluizione del campione con diversi livelli di accoppiamento dell'antigene sono mostrati nella Figura 3. Questa serie iniziale di diluizione è stata testata con una concentrazione fissa di reagenti di rilevamento per ottenere una gamma potenziale di livelli rappresentativi di IFM antigene-specifici e di fondo. Da questi dati, sono stati determinati ulteriori intervalli di diluizione del campione e livelli di accoppiamento dell'antigene e testati ulteriormente con campioni aggiuntivi (dati non mostrati).

Successivamente, la concentrazione del reagente di rilevamento è stata ottimizzata per l'uso con le diverse diluizioni sieriche e i livelli di accoppiamento dell'antigene. I dati rappresentativi che utilizzano 6 campioni positivi e 2 negativi sono mostrati nella Figura 4. A seguito di ulteriori test con diverse centinaia di campioni di siero pre-COVID-19 negativi, i livelli ottimali di accoppiamento dell'antigene finale e le concentrazioni di regent di rilevamento sono stati selezionati per il protocollo di analisi finale, come descritto nella sezione 5.

Conversione in un singolo test di neutralizzazione del reporter
La conversione del singolo saggio sierologico reporter in un test di neutralizzazione è stata ottenuta aggiungendo una fase di incubazione utilizzando ACE2 (come reagente concorrente) con le perle prima di aggiungere il campione di siero. Titolando la quantità di ACE2 aggiunta, è stata osservata l'inibizione del legame di IgG agli antigeni S e RBD, come mostrato nella Figura 5. Mentre gli 11 sieri dei pazienti avevano titoli diversi di IgG, ciascuno mostrava una significativa diminuzione del segnale MFI con l'aumento della concentrazione di ACE2. Come previsto, ACE2 influisce solo sui segnali MFI di S e RBD, ma non sull'antigene Nc.

La percentuale di segnale MFI residuo relativa a 0 μg/mL ACE2 per tutti i campioni è mostrata nella Figura 6. Per la maggior parte dei campioni, è stata osservata una perdita di segnale >30% per S e RBD con aumento della concentrazione di ACE2. Come previsto, non c'è stato alcun effetto di ACE2 sul segnale Nc.

Conversione in un doppio saggio sierologico IgG e IgM a doppio reporter
Per il test IgG e IgM a doppio reporter, sono state utilizzate le condizioni standard del test del singolo reporter per testare diverse combinazioni di anticorpi e reporter per i due canali reporter. Il canale RP1 è simile ai precedenti strumenti di analisi del flusso con rilevamento della fluorescenza "arancione" per coloranti reporter come il PE. Il secondo canale, RP2, impiega un laser di eccitazione viola che può essere utilizzato per rilevare la fluorescenza "blu" di coloranti eccitati a 402 nm con picchi di spettri di emissione nell'intervallo 421-441 nm.

Diverse combinazioni di anticorpi anti-umani IgG e IgM sono state testate a varie concentrazioni con le condizioni standard di diluizione e incubazione del campione di 2.000 volte dettagliate nella sezione 6. Un test iniziale di anti-IgM coniugato al colorante reporter DyLight 405 (DL 405; eccitazione a 400 nm ed emissione a 420 nm) per il canale RP2 è stato eseguito utilizzando una serie di 11 campioni PCR-positivi con DFSO che vanno da 5 a >60 giorni e un campione di siero spogliato di IgG. Questo reagente di rilevamento non ha prodotto un segnale elevato nel canale RP2 come mostrato nella Figura 7A,B, C. Per i campioni con IgM RP2 MFI elevato, i segnali più alti sono stati osservati per RBD e Nc (Figura 7B,C). Mentre i titoli IgM dovrebbero essere elevati in questo momento in alcuni campioni, i livelli di IFM osservati non hanno superato le 140 unità MFI con il reagente di rilevamento IgM. Inoltre, il perle di controllo per IgM mancava di una gamma dinamica significativa per MFI quando si utilizzava DL 405 coniugato a anti-IgM rispetto a un reporter RP1 anti-IgM etichettato con PE utilizzato alle stesse concentrazioni (Figura 7D).

Poiché non era disponibile un reagente di rilevamento RP2 segnalatore adatto per IgM, l'anti-IgG originale di biotina con SASB è stato testato per l'uso nel canale RP2. Il segnale per IgG nel canale RP2 con SASB non aveva la stessa gamma dinamica di SAPE, ma aveva comunque un intervallo adatto per misurare i titoli IgG per S, RBD e Nc (Figura 8). Questi dati hanno portato a testare diverse combinazioni di reagenti di rilevamento RP1 IgM e RP2 IgG, come descritto di seguito.

Conversione al test di neutralizzazione del doppio reporter
Il test sierologico a doppio reporter è stato convertito in un test di neutralizzazione aggiungendo una fase di incubazione con ACE2 e pere, prima di aggiungere il campione di siero. È stata utilizzata una serie di diluizione 2 volte di ACE2 a partire da 16 μg / ml, quindi testata con set di 11 campioni e sieri spogliati come descritto sopra. Inoltre, 3 diverse combinazioni di miscele di anticorpi di rilevamento RP1 IgM e RP2 IgG sono state testate su una serie di 11 campioni e controlli sierici spogliati. Le combinazioni finali e le concentrazioni di reagenti ritenute ottimali sono descritte in dettaglio nella Tabella 1.

Per il rilevamento di IgG, la biotina anti-umana IgG / SASB utilizzata nel test originale del singolo reporter è stata testata insieme a un altro anti-IgG coniugato al colorante BV reporter. Mentre il coniugato BV aveva segnali MFI RP2 elevati, l'intensità del segnale MFI per il titolo IgG variava tra le titolazioni ACE2 (Figura 9A, C, E). La combinazione IgG/SASB anti-human di biotina ha avuto una diminuzione del segnale MFI più consistente attraverso la titolazione ACE2 rispetto al coniugato BV, dimostrando una risposta alla dose, sebbene i livelli di MFI fossero più bassi. La fluttuazione del segnale da parte del coniugato BV tra le concentrazioni di ACE2 ha anche interferito nel determinare l'inibizione percentuale da parte di ACE2 nell'intervallo dei titoli IgG rispetto alla combinazione IgG/SASB anti-umana di biotina (Figura 9B,D, F). I campioni con segnali MFI bassi, come il campione DFSO 3, non hanno titoli abbastanza alti per valutare le prestazioni di questi reagenti o misurare la capacità di neutralizzazione IgG.

Per determinare i titoli IgM nel canale RP1, un anti-IgM coniugato con PE è stato confrontato con un IgM anti-umano coniugato al colorante reporter DyLight 549 (DL 549; eccitazione a 562 nm ed emissione a 576 nm) alle concentrazioni elencate nella Tabella 1. Di questi due reagenti, l'anti-IgM PE ha mostrato IFM più elevate di quelle generate da DL 549 IgM anti-umano per i campioni testati (Figura 9A,C,E). Il perle di controllo IgM che misurava l'aggiunta di questi reagenti aveva diverse IFM medie di ≈ 17.000 per l'anti-IgM PE e 2.723 per il coniugato DL 549. Anche con queste differenze, l'impatto delle varie concentrazioni di ACE2 sulle IFM è stato misurabile con il coniugato DL 549. Per determinare l'inibizione ACE2% del legame IgM, c'era una leggera ma insignificante differenza tra i due reagenti di rilevamento IgM (Figura 9B, D , F).

CombinazioneCronistaConcentrazione finale nel pozzo (μg/mL)
RP1RP2
1PE anti-IgM2-
Biotina-Ig-0.62
SASB ·-4
2DyLight 549 IgM anti-umano1-
Viola Brillante 421 Anti-Human IgG-1
3DyLight 549 IgM anti-umano1-
Biotina-Ig-0.62
SASB ·-4

Tabella 1: Elenco delle combinazioni di coloranti reporter RP1 e RP2 testate. Diversi coloranti reporter RP1 e RP2 sono stati valutati per misurare i titoli IgG e IgM. Le tre combinazioni mostrate sopra sono state testate in diverse modalità di rilevamento RP1 e per l'ottimizzazione del test di neutralizzazione. Per le combinazioni di RP2 che utilizzano SASB, vengono mostrate le concentrazioni per l'anticorpo di rilevamento biotinilato e SASB. *La concentrazione finale rappresenta la concentrazione finale nel pozzo di reazione.

figure-results-1
Figura 1: Diagramma di flusso che evidenzia i principali passaggi del protocollo di analisi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Conferma dell'accoppiamento dell'antigene. Gli antigeni sono stati accoppiati a 100, 10 e 1 pmol/106 perme. Per gli antigeni S e RBD, i sieri anti-S di coniglio sono stati utilizzati e rilevati con PE anti-coniglio IgG. Per Nc, è stato utilizzato un policlonale di coniglio purificato con proteina G anti-Nc. Vengono mostrate le curve di titolazione per le perle accoppiate con 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) e 100 pmol Nc (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Ottimizzazione della diluizione sierica con diversi livelli di accoppiamento dell'antigene. I campioni di siero che rappresentano campioni alti, medi, bassi e negativi sono stati testati con i diversi accoppiamenti antigene pmol/106 perle. Una titolazione sierica di 4 volte è stata testata con una miscela multiplex di perle accoppiate all'antigene utilizzando il protocollo di dosaggio descritto nel paragrafo 5. Vengono mostrati i valori IFM delle curve di titolazione per S (A), RBD (B) e Nc (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Determinazione della diluizione sierica ottimale e concentrazione del reagente di rilevamento. Otto campioni di siero, tra cui pazienti negativi (2 campioni) e da bassi ad alti positivi (6 campioni), sono stati testati a ulteriori diluizioni sieriche con tre diverse concentrazioni di reagenti di rilevamento. I risultati delle IFM sono mostrati per S (A), RBD (B) e Nc (C). Sulla base di questi e di altri dati (non mostrati), è stata selezionata una diluizione del campione di 1:2.000 e una concentrazione di anticorpi per il rilevamento della biotina di 0,62 μg/ml. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Ottimizzazione del test di neutralizzazione del singolo reporter. La modifica del singolo saggio sierologico reporter in un test di rilevamento degli anticorpi neutralizzanti è stata eseguita aggiungendo una fase di incubazione con ACE2 come concorrente, come descritto nella Sezione 6. Una serie di 11 campioni, che vanno dai sieri a titolo basso ad alto positivo, e un campione di siero a strisce IgG sono stati testati con una serie di diluizione doppia di ACE2 a partire da 4 μg / mL, utilizzando condizioni di dosaggio standard. In questo intervallo di concentrazioni di ACE2, si può vedere una diminuzione dell'IFM con un aumento di ACE2 per S (A) e RBD (B), ma non per Nc (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 6: Inibizione percentuale del segnale con ACE2. Vengono mostrati i segnali residui percentuali per il set di 11 campioni (dalla Figura 4). Per ogni campione, indipendentemente dal titolo IgG, è stata raggiunta una diminuzione massima del segnale MFI ≥30% per S (A) e RBD (B) alla massima concentrazione di ACE2. Per l'antigene Nc (C) non vi è stata alcuna inibizione significativa del segnale con qualsiasi quantità di ACE2 testata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Test di DyLight 405 anti-IgM come reagente di rilevamento IgM RP2. Una serie di 11 campioni e sieri spogliati di IgG sono stati utilizzati per testare l'anti-IgM coniugato DL 405 come reagente di rilevamento RP2. Vengono mostrati i segnali IFM IgM RP2 per S (A), RBD (B) e Nc (C). Il segnale MFI più alto per qualsiasi antigene con qualsiasi campione era di circa 140 unità MFI per RBD con campione H (B). Anche il segnale sul set di perle di controllo IgM era inferiore a 1.000 MFI nel canale RP2 su tutta la gamma di titoli anticorpali e non mostrava l'aumento della gamma dinamica osservata con l'anticorpo di rilevamento anti-IgM PE nel canale RP1 (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-8
Figura 8: Ottimizzazione di SASB come reporter RP2 con Biotina anti-IgG. Una serie di 11 campioni e sieri spogliati di IgG sono stati utilizzati per testare una serie di diluizione di SASB con lo standard 0,62 μg / mL biotina anti-IgG. Vengono mostrate le IFM IgG risultanti nel canale RP2 per S (A), RBD (B) e Nc (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-9
Figura 9: Confronto di tre diverse combinazioni di miscele di rilevamento RP1 IgM e RP1 IgG. Tre diverse miscele di anticorpi di rilevamento sono state testate su 11 campioni e sieri spogliati di IgG. Le combinazioni e le concentrazioni finali utilizzate sono descritte nella Tabella 1. Tutti i campioni sono stati testati con una diluizione ACE2 2 volte superiore, a partire da 16 μg/mL. Vengono mostrati i dati per i campioni presso DFSO di 3, 12 e 30 giorni. I segnali MFI per RP1 IgM (arancione) e RP2 IgG (blu) sono mostrati in A (DFSO 3), C (DFSO 12) ed E (DFSO 30). Le IFM residue ACE2% sono mostrate in B (DFSO 3), D (DFSO 12) e F (DFSO 30). I segnali che rappresentano una diminuzione del >30% rispetto a Nessun controllo ACE2 sono evidenziati in verde chiaro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio ha ampliato la funzionalità di un test multisplo di microsfere fluorescenti, 3Flex, che valuta qualitativamente la risposta IgG all'infezione da SARS-CoV-21. Mentre molti test sierologici per COVID-19 rilevano un singolo antigene, questo test valuta contemporaneamente gli antigeni S, RBD e Nc e include un controllo interno dell'isotipo anticorpale7. Inoltre, ACE2 viene utilizzato come indicatore per rilevare i titoli anticorpali neutralizzanti a SARS-CoV-2.

I saggi multigenici possono essere particolarmente utili in futuro per discriminare le risposte immunitarie tra persone infette e vaccinate. Con SARS-CoV-2, se vengono valutati solo gli anticorpi S e RBD, sarebbe impossibile discernere se ciò fosse dovuto a un'infezione passata o a una risposta anticorpale vaccinale. Nessuno dei vaccini attualmente in uso ha come bersaglio l'antigene Nc, quindi valutando gli antigeni S/RBD e Nc, è possibile distinguere l'infezione virale passata (Nc- e S/RBD-positiva) da una risposta vaccinale (solo S/RBD-positiva; Nc-negativo).

Nel presente studio, i saggi sierologici e di neutralizzazione 3Flex (sezioni 5 e 6) sono stati trasferiti su un nuovo strumento di analisi del flusso a doppio reporter (sezioni 7 e 8). I protocolli di immunosaggio tipici per i saggi multiplex basati su perle sono simili ai protocolli ELISA standard, seguendo passaggi comparabili per l'incubazione del campione, l'incubazione di anticorpi / reporter di rilevamento e l'analisi dei risultati8. Studi precedenti hanno anche dimostrato come i saggi ELISA standard possono essere trasferiti su una piattaforma di multiplexing basata su perle9.

I protocolli di analisi potrebbero essere trasferiti senza soluzione di continuità dal precedente strumento a singolo reporter al nuovo sistema a doppio reporter, come dimostrano i risultati ottenuti per i campioni e i controlli di prova (Figura 4 e Figura 5). Nel test sierologico, tutti i campioni di siero positivi hanno dimostrato una caratteristica diminuzione del segnale dose-responsiva corrispondente sia a una maggiore diluizione del campione che a una minore concentrazione di anticorpi di rilevamento, mentre i segnali per i campioni negativi sono rimasti a livelli di fondo. Allo stesso modo, per il test di neutralizzazione, i segnali decrescenti per S e RBD, ma non Nc, corrispondevano a concentrazioni crescenti del concorrente ACE2, mentre il siero spogliato di IgG era molto meno influenzato dall'aggiunta di ACE2. La pre-incubazione delle perle con ACE2 per 2 minuti prima dell'aggiunta del campione di siero (come descritto nei paragrafi 6 e 8), è stata anche confrontata con la combinazione delle perle con ACE2 e siero allo stesso tempo e ha prodotto una piccola differenza nei risultati (dati non mostrati). Tuttavia, poiché i risultati ottenuti con le perle più la fase di pre-incubazione ACE2 erano più coerenti, è stata la procedura finale adottata per il protocollo di test di neutralizzazione (sezioni 6 e 8).

Poiché il sistema dual reporter incorpora un secondo canale reporter fluorescente, entrambi i saggi sono stati convertiti in saggi di isotipizzazione per misurare contemporaneamente le risposte IgG e IgM. La funzionalità dual reporter dell'analizzatore di flusso consente la raccolta di segnali fluorescenti da due reagenti di rilevamento reporter per ciascun analita nel multiplex per ciascun campione, raddoppiando efficacemente i dati generati per campione in un test. Per lo sviluppo e l'ottimizzazione dei protocolli di analisi dual reporter, sono stati valutati diversi coloranti reporter disponibili in commercio e anticorpi di rilevamento per il nuovo canale RP2 (Figura 7 e Figura 8) per determinare le migliori opzioni disponibili. L'anticorpo anti-IgM coniugato con il colorante reporter DL 405 non ha funzionato bene nel canale RP2 (Figura 7), quindi la biotina anti-IgG con SASB è stata successivamente valutata per il rilevamento nel canale RP2 (Figura 8). Tre combinazioni di reagenti di rilevamento RP1 e RP2 sono state confrontate nel test di neutralizzazione a doppio reporter (Tabella 1 e Figura 9) per determinare le combinazioni più performanti per il rilevamento simultaneo di anticorpi neutralizzanti IgG e IgM. Mentre c'erano differenze significative nell'intensità del segnale tra il canale RP1 che utilizzaVA PE-anti IgM e il canale RP2 che utilizzava DL 549 anti-IgM, non vi era alcuna differenza significativa nella misurazione dell'inibizione percentuale del legame da parte di ACE2.

Diverse limitazioni al metodo attuale e questo studio sono riconosciuti. In primo luogo, i campioni testati e utilizzati nello sviluppo e nell'ottimizzazione del metodo erano limitati a serie di 8-11 campioni. Altri campioni saranno testati in studi ampliati per verificare che il metodo sia completamente ottimizzato. In secondo luogo, è stato testato un numero limitato di fluorofori reporter e coppie di reporter. Ulteriori test di tutti i reporter disponibili in tutte le possibili combinazioni determineranno quali reagenti possono essere utilizzati con successo in questo metodo. L'anticorpo anti-IgG coniugato alla biotina era diverso dall'anticorpo anti-IgG coniugato al reporter BV 421. Quindi, sebbene esistesse variabilità nell'intensità del segnale per l'anti-IgG BV 421, potrebbe essere dovuta alla specificità dell'anticorpo e non correlata al colorante reporter. Il test di altri anticorpi coniugati BV 421 disponibili può identificare un altro anticorpo che funzionerebbe bene nel canale RP2. Studi futuri valuteranno anche la combinazione di PE anti-IgM con BV 421 anti-human IgG per il rilevamento in RP1 e RP2, rispettivamente. Infine, anche con la capacità di doppio reporter dello strumento, i saggi sono limitati a due isotipi (due parametri) per reazione. Se devono essere misurati isotipi aggiuntivi o si desidera un isotipizzazione completa, allora ulteriori reazioni utilizzando gli stessi due canali reporter dovrebbero essere eseguite in pozzi separati.

La tecnologia di multiplexing basata su perle consente una progettazione rapida e flessibile del saggio con una facile implementazione nei flussi di lavoro di laboratorio di routine3,4,10. Questo studio ha dimostrato la facilità nel trasferire i saggi sierologici e di neutralizzazione 3Flex precedentemente descritti per SARS-CoV-2 su un sistema di analisi del flusso per misurare IgG con un singolo reporter, o con lievi modifiche, misurando contemporaneamente sia le risposte IgG che IgM utilizzando due reporter. L'opzione dual reporter ha chiari vantaggi rispetto alle piattaforme a singolo reporter perché può fornire il doppio dei dati per campione, utilizzando metà del volume del campione e metà del numero di pozzi di reazione. Con i coloranti reporter appropriati e gli anticorpi di rilevamento, i saggi di isotipizzazione possono essere facilmente sviluppati ed eseguiti sullo strumento di analisi del flusso a doppio reporter.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stephen Angeloni e Sherry Dunbar sono dipendenti di Luminex Corporation che produce alcuni dei reagenti e degli strumenti utilizzati in questo studio. La pubblicazione Open Access di questo articolo è stata sponsorizzata da Luminex Corporation

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo rapporto è stato finanziato da Luminex Corporation (Austin, TX). Gli autori ringraziano Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) per l'assistenza all'editing scientifico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ACE2 (umano) (rec.)AdipoGen Life SciencesAG-40B-0192-3050
Biotina-SP (spaziatore lungo) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ frammento specificoJackson ImmunoResearch Laboratories109-065-098
Albumina sierica bovinaMilliporeSigmaA7888Sigma-Aldrich
Branson 1800 Pulitore/sonicatore a bagno d'acquaVari
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch Laboratories709-675-149
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS MicroplateCorning3650
Corning 96-well Microplate Nastro sigillante in alluminio, non sterileCorning6570
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ   frammento specificoJackson ImmunoResearch Laboratories109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Capra Anti-Human IgM Fc5μ specificoJackson ImmunoResearch Laboratories109-506-129Fuori produzione ma disponibile da più fornitori
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 ConiugatoThermoFisher Scientific62-4317-82
Fisherbrand Agitatore per micropiastre in incubazioneThermoFisher Scientific02-217-757Fisher Scientific
Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-coniglio anti-coniglioThermoFisher ScientificP-2771MP
Luminex SeparatoreLuminex CorporationCN-0269-01
Perline MagPlexLuminex CorporationMC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 IgM anti-umano di capra Fc5μ specificoJackson ImmunoResearch Laboratories109-116-129
Soluzione salina tamponata con fosfatoMilliporeSigmaP3813Sigma-Aldrich
SARS Nucleocapsid Protein AntibodyNovos BiologicalsNB100-56683Non coniugato, coniglio, policlonale, proteina G purificato
SARS Nucleocapside ProteinaAnticorpo Novos BiologicalsNB100-56049Non coniugato, coniglio, policlonale, proteina A purificata
SARS Spike Protein AntibodyNovos BiologicalsNB100-56047Non coniugato, coniglio, policlonale, proteina G purificata
SARS Spike Protein AnticorpoNovos BiologicalsNB100-56048Non coniugato, coniglio, policlonale, proteina G purificato
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Anticorpo, coniglio MAbSinoBiological40150-R007
Sodio azideMilliporoSigmaS2002Sigma-Aldrich
Streptavidina, R-ficoeritrina coniugato (SAPE)ThermoFisher ScientificS21388
revolver / rotatore a tuboThermoFisher Scientific88881001
TWEEN 20MilliporeSigmaP9416Sigma-Aldrich
xMAP Kitdi couplng anticorpoLuminex Corporation40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SELuminex CorporationINTELLIFLEX-DRSE-RUO
Fisher Scientific P-2771MP, PE magnetico per piastre di qualità premium

Riferimenti

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  1. Cameron, A., et al. A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489(2020).
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  4. Ayouba, A., et al. Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).
  5. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).
  6. Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/ (2020).
  7. EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
  8. Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf (2021).
  9. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments. (65), e4084(2012).
  10. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).

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