Analisi della costante molecolare della molla mediante spettroscopia a sonda a forza biomembrana

Summary

Una sonda di forza biomembrana (BFP) è una tecnica di spettroscopia di forza dinamica in situ (DFS). La BFP può essere utilizzata per misurare la costante di molla delle interazioni molecolari sulle cellule viventi. Questo protocollo presenta l'analisi costante a molla per i legami molecolari rilevati da BFP.

Abstract

Una sonda di forza biomembrana (BFP) è recentemente emersa come nanostrutto per spettroscopia di forza dinamica (DFS) a superficie cellulare nativa o in situ in grado di misurare la cinetica di legame molecolare singolo, valutare le proprietà meccaniche delle interazioni ligando-recettore, visualizzare i cambiamenti conformazionali dinamici della proteina e chiarire in modo più eccitante i meccanismi di meccanosensing cellulare mediati dal recettore. Più recentemente, la BFP è stata utilizzata per misurare la costante di molla dei legami molecolari. Questo protocollo descrive la procedura passo-passo per eseguire l'analisi DFS a molla molecolare costante. In particolare, vengono discusse due modalità operative BFP, vale a dire le modalità Bead-Cell e Bead-Bead. Questo protocollo si concentra sulla derivazione di costanti molle del legame molecolare e della cellula dai dati grezzi DFS.

Introduction

Come tecnica DFS a cellule vive, BFP progetta un globuli rossi umani (RBC; Figura 1) in un trasduttore di forza ultrasensibile e sintonizzabile con un intervallo costante di molla compatibile a 0,1-3 pN/nm^1,2,3. Per sondare l'interazione ligando-recettore, BFP consente misurazioni DFS a ~ 1 pN^{(10 -12} N), ~ 3 nm^{(10 -9} m) e ~ 0,5 ms^{(10 -3} s) in forza, risoluzione spaziale e temporale^4,5. La sua configurazione sperimentale è costituita da due micropipette opposte, ovvero la sonda e il bersaglio. La micropipetta Probe aspira un RBC e una perle viene incollata al suo apice tramite un'interazione biotina-streptavitina. Il perno è rivestito con il ligando di interesse (Figura 1A). La micropipetta target aspira una cellula o una perna che porta il recettore di interesse, corrispondente rispettivamente alle modalità Bead-Cell (Figura 1B) e Bead-Bead (Figura 1C), rispettivamente⁵.

La costruzione, l'assemblaggio e i protocolli sperimentali DFS BFP sono stati descritti in dettaglio in precedenza^1,6. In breve, un ciclo tattile BFP è costituito da 5 fasi: Approccio, Impinge, Contatto, Retract e Dissociate (Figura 1D). La posizione dell'apice RBC orizzontale è indicata come Δx_RBC. All'inizio, la deformazione RBC non accentata (forza zero) Δx_RBC è 0 (Tabella 1). Il bersaglio viene quindi guidato da un piezotraduatore per impattarsi e ritrarsi dal perla della sonda (Figura 1D). La sonda RBC viene prima compressa dal Target con deformazione RBC negativa Δx_RBC < 0. In un evento di legame, lo stadio di retrazione passa da una fase di compressione a una fase di trazione con deformazione RBC positiva Δx_RBC > 0 (Figura 2C e D). Secondo la legge di Hooke, la forza portante BFP può essere misurata come F = k_RBC × Δx_RBC, dove k_RBC ( Tabella1) è la costante della molla RBC del BFP. Dopo la rottura del legame e il completamento di un ciclo di tocco, il perle della sonda ritorna in posizione di forza zero con Δx_RBC = 0 (Figura 1D).

Per determinare il k_RBC,misuriamo e registriamo i raggi dell'orifizio interno della micropipetta della sonda (R_p), l'RBC (R₀) e l'area di contatto circolare (R_c) tra l'RBC e il perlo della sonda ( Figura1A). Quindi k_RBC viene calcolato secondo il modello di Evan (Eq. 1)^7,8 utilizzando un programma LabVIEW che funge da strumento virtuale (VI) per far funzionare il BFP(Figura S1A)^8,9.

(Eq. 1)

Con un BFP stabilito e i dati grezzi DFS ottenuti, presentiamo come analizzare la costante di molla della coppia o delle cellule ligando-recettore. I dati grezzi DFS sull'interazione della proteina glicosilata Thy-1 e della cellula K562 portante integrina α₅β₁ (Thy-1-α₅β₁; Figure 3A e 3B)¹⁰ e quella dell'integrina rivestita di fibrinogeno e perle α_IIbβ₃ (FGN-α_IIbβ₃; Figura 3C) ^11,12 sono stati utilizzati per dimostrare le modalità di analisi Bead-Cell e Bead-Bead, rispettivamente.

Preparazione sperimentale BFP
Per i dettagli sulla preparazione sperimentale e la strumentazione BFP, fare riferimento ai protocolli³precedentemente pubblicati. In breve, l'RBC umano è stato biotinilato utilizzando la Biotina-PEG3500-NHS nel tampone di carbonio / bicarbonato. Le proteine di interesse sono state accoppiate covalentemente alle perle di vetro borosilicato utilizzando MAL-PEG3500-NHS nel tampone fosfato. Per attaccarsi al RBC biotinilato, il perla della sonda è anche rivestito con streptavitina (SA) utilizzando il MAL-SA. Si prega di consultare la Tabella dei materiali e la Tabella 2.

Per assemblare il BFP (Figura 1, a sinistra), la terza micropipetta denominata 'Helper' verrà utilizzata per consegnare la sonda e incollarla all'apice del RBC^1,3. L'interazione covalente tra il perle della sonda rivestito sa e l'RBC biotinilato è molto più forte del legame ligando-recettore di interesse. Pertanto, lo stadio di dissociato può essere interpretato come la rottura del legame ligando-recettore piuttosto che il distacco del perlo della sonda dal RBC.

Protocol

1. Ottenere eventi DFS analizzabili

1. Avviare l'esperimento nel software (ad esempio, LabVIEW VI) per il controllo BFP e l'impostazione dei parametri (Figura S1A).
2. Osservare i ripetitivi tocchi di perle/celle del bersaglio della sonda nel software per BFP Monitor (Figura S1B).
3. Testare e raggiungere la frequenza di adesione ≤ 20% entro i primi 50 tocchi regolando la forza di impingement e il tempo di contatto, con cui assicura che ≥'89% dell'evento di adesione DFS siano mediati da singoli legami^12,13,14.
   NOTA: per ogni coppia Bead-Cell/Bead, eseguiamo 200 cicli tattili ripetitivi. Per ottenere una qualità dei dati pubblicabile, di solito eseguiamo n ≥ 3 coppie Bead-Bead o Bead-Cell.
   1. Salva i dati, sotto forma di Forza vs. Tempo, nella cartella diretta dall'utente entro la fine di ogni coppia, richiesto dal software per il controllo BFP e l'impostazione dei parametri.
4. Raccogliere i dati grezzi Force vs. Time degli eventi bond, come esemplificato nella Figura 2A,utilizzando la piattaforma di acquisizione BFP (Figura S1C).
   1. Aprire il software di analisi dei dati BFP. Fare clic sull'icona della cartella gialla e selezionare il file di dati grezzi corrispondente facendo doppio clic su di essi.
5. Eseguire il programma, quindi fare clic sul pulsante su e giù per passare da un evento all'altro. Utilizzare i criteri di esclusione outlier (Figura S2) per escludere gli eventi non validi. Selezionare il tipo di dati di esportazione come formato Forza vs. Tempo e fare clic sul pulsante Esporta dati grafici.

2. Converti la curva forza vs. tempo nella curva forza vs. spostamento

1. Esportare il segmento di dati corrispondente alla fase Retract in un foglio di calcolo (Figura 2A, tendone quadrato), che è rilevante per l'analisi della costante della molla.
2. Traccia la curva forza rispetto a time utilizzando un software per fogli di calcolo. Per ottenere la curva Force vs. Displacment, convertire i valori temporali(Figura 2A, asse x)nei valori di spostamento totale (Δx_tot)moltiplicando i valori temporali con la velocità di movimento piezoelettrico (cioè 4.000 nm/s per preset).
3. Azzerare il primo punto dati sottraendo il valore di spostamento più piccolo da ogni valore di spostamento acquisito. Questa trasformazione orizzontale non influisce sulle pendenze ascendenti dello stadio Retract né sul successivo calcolo della costante di molla.
4. In particolare, il BFP è considerato come un sistema a molla_seriale in cui Δxtot ( Tabella1) sommano le deformazioni del RBC, Δx_RBC ( Tabella1), il legame molecolare, Δx_mol ( Tabella1), e la cellula bersaglio,_cella Δx( Tabella1), come Eq. 2:
   (Eq. 2)
5. Tracciate la curva Forza (F) vs. Spostamento (Δx_tot) come mostrato nella Figura 2B.

3. Analisi della molla Cnstant della modalità Bead-Cell

1. Nella curva Forza vs. Spostamento, si possono identificare due pendenze distinte, in cui ciascuna può rappresentare la fase di compressione e la fase di trazione. Adattare una linea di regressione a ciascun gruppo di dati (Figura 2B), dove la pendenza di adattamento lineare più grande rappresenta la costante totale della molla in fase di compressione (Figura 2B, rosso), indicata come k₁ (Tabella 1); e la pendenza di adattamento lineare più piccola rappresenta la costante totale della molla in fase di tenslile (Figura 2B, blu), denotata come k₂ (Tabella 1).
2. Per le molle collegate in serie per la descrizione del passo 2.2, esprimere il reciproco della costante totale della molla, k_tot (Tabella 1), come somma degli inversi costanti della molla di RBC, k_RBC (Tabella 1), il legame molecolare, k_mol (Tabella 1) e la cella bersaglio, _{k cella} (Tabella 1). Durante la fase compressiva del modo Bead-Cell, il legame molecolare non viene allungato, quindi k_mol non viene preso in considerazione. Il reciproco del k_tot in questo scenario (1/k₁) è espresso come
   (Eq. 3).
   Nei dati di esempio, k_RBC è predeterminato (0,25 pN/nm per impostazione predefinita). k_cell può essere derivata dall'Eq. 3 con il K₁ e k_RBC acquisito ( Figura3B).
3. Durante la fase di trazione, si forma l'adesione tra la coppia ligando-recettore. Esprimere il reciproco del k_tot in questo scenario (1/k₂) come
   (Eq. 4)
   dove k₂ (Tabella 1) rappresenta la costante totale della molla durante la fase di trazione.
4. Derivare k_mol sottraendo 1/k₁ da 1/k₂ (confrontare Eq. 3 vs Eq. 4).

4. Analisi costante della molla della modalità Perla- perla

1. Adattare una linea di regressione ai dati della fase di compressione per ottenere k₁ (simile alla Figura 2B, rossa). Da notare, nella modalità Bead-Bead, la cellula Target è sostituita da una perle di vetro rivestita con il recettore di interesse (Figura 1C). Poiché la deformazione del perle è trascurabile, il termine_cellulare 1/kpuò essere rimosso dall'Eq. 3 e dall'Eq. 4 di conseguenza. Il k_tot reciproco della fase compressiva (1/k₁) può essere espresso come:
   (Eq. 5)
2. Adattare una linea di regressione ai dati della fase di trazione per ottenere k₂ (simile alla Figura 2B, blu). Il k_tot reciproco della fase di trazione (1/k₂) può essere espresso come:
   (Eq. 6)
3. Derivare k_mol sottraendo 1/k₁ da 1/k₂ (confrontare Eq. 5 vs Eq. 6).

Results

In questo lavoro, abbiamo dimostrato il protocollo dell'analisi costante della molla BFP. Per la modalità di analisi Bead-Cell, abbiamo analizzato il k_mol del legame molecolare tra la proteina glicosilata Thy-1 rivestita sul probe bead e l'integrina α₅β₁ espressa sulla cellula Target K562 (Thy-1-integrina α₅β₁; Figura 3A) ¹⁰. La_cella kderiva anche dal modo Bead-Cell (K562 Cell;

Discussion

In sintesi, abbiamo fornito un protocollo di analisi dei dati dettagliato per la pre-elaborazione dei dati grezzi DFS e la derivazione di costanti molecolari a molla nelle modalità di analisi BFP Bead-Bead e Bead-Cell. Vengono presentati i modelli biomeccanici e le equazioni necessarie per determinare le costanti molecolari e cellulari della molla. Sebbene siano studiate integrine diverse, la k_mol misurata dal modo Bead-Bead e il modo Bead-Cell possiedono differenze di gamma significative ( Figura

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Mercaptopropiltrimetossisilano (MPTMS)	Uct, Specialties, llc	4420-74-0	Funzionalizzazione di perle di vetro
. Sodio fosfato bibasico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Preparazione del tampone fosfato
Acquisizione dati BFP VI	Controllo LabVIEW		BFP e impostazione dei parametri
Analisi dei dati BFP VI	dei dati grezzi	LabVIEW
Biotin-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	Biotinilazione
dei globuli rossiPerle di vetro borosilicato	Distrilab Particle Technology, Paesi Bassi	9002	Funzionalizzazione di perle di vetro
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A0336	Funzionalizzazione del ligando
Camera VI LabVIEW			BFP monitoring
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G7021	Tyrode' s preparazione tampone
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode' s preparazione del tampone
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	Funzionalizzazione di perle di vetro
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Tyrode' s preparazione del tampone
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Preparazione del tampone carbonato/bicarbonato; Tyrode'
Carbonato di sodio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Preparato tampone carbonato/bicarbonato
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tyrode' Preparazione del tampone
Fosfato di sodio monobasico monoidrato (NaH2PO4&bolle; H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Preparazione del tampone fosfato
Streptavidina-Maleimmide	Sigma-Aldrich	S9415	Funzionalizzazione di perle di vetro