Una sonda di forza biomembrana (BFP) è una tecnica di spettroscopia di forza dinamica in situ (DFS). La BFP può essere utilizzata per misurare la costante di molla delle interazioni molecolari sulle cellule viventi. Questo protocollo presenta l'analisi costante a molla per i legami molecolari rilevati da BFP.
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Articolo metodologico
Analisi della costante molecolare della molla mediante spettroscopia a sonda a forza biomembrana
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una sonda di forza biomembrana (BFP) è recentemente emersa come nanostrutto per spettroscopia di forza dinamica (DFS) a superficie cellulare nativa o in situ in grado di misurare la cinetica di legame molecolare singolo, valutare le proprietà meccaniche delle interazioni ligando-recettore, visualizzare i cambiamenti conformazionali dinamici della proteina e chiarire in modo più eccitante i meccanismi di meccanosensing cellulare mediati dal recettore. Più recentemente, la BFP è stata utilizzata per misurare la costante di molla dei legami molecolari. Questo protocollo descrive la procedura passo-passo per eseguire l'analisi DFS a molla molecolare costante. In particolare, vengono discusse due modalità operative BFP, vale a dire le modalità Bead-Cell e Bead-Bead. Questo protocollo si concentra sulla derivazione di costanti molle del legame molecolare e della cellula dai dati grezzi DFS.
Introduzione
Come tecnica DFS a cellule vive, BFP progetta un globuli rossi umani (RBC; Figura 1) in un trasduttore di forza ultrasensibile e sintonizzabile con un intervallo costante di molla compatibile a 0,1-3 pN/nm1,2,3. Per sondare l'interazione ligando-recettore, BFP consente misurazioni DFS a ~ 1 pN(10 -12 N), ~ 3 nm(10 -9 m) e ~ 0,5 ms(10 -3 s) in forza, risoluzione spaziale e temporale4,5. La sua configurazione sperimentale è costituita da due micropipette opp....
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Protocollo
1. Ottenere eventi DFS analizzabili
- Avviare l'esperimento nel software (ad esempio, LabVIEW VI) per il controllo BFP e l'impostazione dei parametri (Figura S1A).
- Osservare i ripetitivi tocchi di perle/celle del bersaglio della sonda nel software per BFP Monitor (Figura S1B).
- Testare e raggiungere la frequenza di adesione ≤ 20% entro i primi 50 tocchi regolando la forza di impingement e il tempo di contatto, con cui assicura che ≥'89% dell'evento di adesione DFS siano mediati da singoli legami12,13,14.
NOTA: pe....
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Risultati
In questo lavoro, abbiamo dimostrato il protocollo dell'analisi costante della molla BFP. Per la modalità di analisi Bead-Cell, abbiamo analizzato il kmol del legame molecolare tra la proteina glicosilata Thy-1 rivestita sul probe bead e l'integrina α5β1 espressa sulla cellula Target K562 (Thy-1-integrina α5β1; Figura 3A) 10. Lacella kderiva anche dal modo Bead-Cell (K562 Cell;
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Discussione
In sintesi, abbiamo fornito un protocollo di analisi dei dati dettagliato per la pre-elaborazione dei dati grezzi DFS e la derivazione di costanti molecolari a molla nelle modalità di analisi BFP Bead-Bead e Bead-Cell. Vengono presentati i modelli biomeccanici e le equazioni necessarie per determinare le costanti molecolari e cellulari della molla. Sebbene siano studiate integrine diverse, la kmol misurata dal modo Bead-Bead e il modo Bead-Cell possiedono differenze di gamma significative ( Figura
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti da riferire in merito al presente studio.
Ringraziamenti
Ringraziamo Guillaume Troadec per l'utile discussione, Zihao Wang per la consulenza hardware e Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning e Simon Ringer per il supporto della nostra startup di laboratorio. Questo lavoro è stato supportato dall'Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), nsw Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) e The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Eq....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3-Mercaptopropiltrimetossisilano (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Funzionalizzazione di perle di vetro |
| . Sodio fosfato bibasico (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Preparazione del tampone fosfato |
| Acquisizione dati BFP VI | Controllo LabVIEW | BFP e impostazione dei parametri | |
| Analisi dei dati BFP VI | dei dati grezzi | LabVIEW | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | Biotinilazione |
| dei globuli rossiPerle di vetro borosilicato | Distrilab Particle Technology, Paesi Bassi | 9002 | Funzionalizzazione di perle di vetro |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A0336 | Funzionalizzazione del ligando |
| Camera VI LabVIEW | BFP monitoring | ||
| D-glucosio | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode' s preparazione tampone |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode' s preparazione del tampone |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Funzionalizzazione di perle di vetro |
| Cloruro di potassio (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode' s preparazione del tampone |
| Bicarbonato di sodio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Preparazione del tampone carbonato/bicarbonato; Tyrode' |
| Carbonato di sodio (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Preparato tampone carbonato/bicarbonato |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode' Preparazione del tampone |
| Fosfato di sodio monobasico monoidrato (NaH2PO4&bolle; H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Preparazione del tampone fosfato |
| Streptavidina-Maleimmide | Sigma-Aldrich | S9415 | Funzionalizzazione di perle di vetro |
Riferimenti
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A.
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Ristampe e permessi
