Questo protocollo presenta un confronto tra due diversi protocolli di induzione per differenziare le cellule staminali della polpa dentale umana (hDPSC) verso le linee pancreatiche in vitro:il protocollo integrativo e il protocollo non integrativo. Il protocollo integrativo genera più cellule produttrici di insulina (IPC).
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Articolo metodologico
In vitro Induzione di cellule staminali della polpa dentale umana verso lignaggi pancreatici
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
A partire dal 2000, il successo del trapianto di isole pancreatiche utilizzando il protocollo di Edmonton per il trattamento del diabete mellito di tipo I ha ancora affrontato alcuni ostacoli. Questi includono il numero limitato di donatori di pancreas cadaverico e l'uso a lungo termine di immunosoppressori. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state considerate un potenziale candidato come fonte alternativa di generazione di cellule simili a isole. I nostri rapporti precedenti hanno illustrato con successo la creazione di protocolli di induzione per differenziare le cellule staminali della polpa dentale umana (hDPSC) dalle cellule produttrici di insulina (IPC). Tuttavia, l'efficienza di induzione variava notevolmente. In questo articolo, dimostriamo il confronto tra l'efficienza di induzione pancreatica delle hDPSC tramite protocolli di induzione integrativi (microambiente e genetica) e non integrativi (manipolazione microambiente) per la fornitura di IPC derivati da hDPSC (hDPSC-IPC). I risultati suggeriscono un'efficienza di induzione distinta per entrambi gli approcci di induzione in termini di struttura della colonia tridimensionale, resa, marcatori di mRNA pancreatico e proprietà funzionali sulla sfida del glucosio multidosaggio. Questi risultati supporteranno la futura creazione di una piattaforma di produzione di IPC e lignaggio pancreatico clinicamente applicabile.
Introduzione
Il diabete mellito è una preoccupazione globale in corso. Un rapporto dell'International Diabetes Federation (IDF) ha stimato che la prevalenza globale del diabete aumenterebbe da 151 milioni nel 2000 a 415 milioni nel 20151,2. L'ultimo studio basato sull'epidemiologia ha previsto che la prevalenza stimata del diabete in tutto il mondo aumenterà da 451 milioni nel 2017 a 693 milioni nel 20451. Il successo del trapianto di isole pancreatiche utilizzando il protocollo di Edmonton è stato dimostrato per la prima volta nel 2000, quando è stato dimostrato che mantiene la produzione endogena ....
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Protocollo
Questo lavoro è stato eseguito in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico della Ricerca Umana, Facoltà di Odontoiatria, Università Chulalongkorn. Le DPSC umane (hDPSC) sono state isolate dai tessuti della polpa dentale umana estratti sia dai premolari che dai molari a causa di problemi ai denti del giudizio. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti in base a un protocollo approvato (HREC-DCU 2018/054).
1. Protocollo di induzione integrativa
- Preparazione del vettore lentivirale che trasporta PDX1
- Utilizzare cellule di rene embrionale umano (HEK) 293FT per il confezion....
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Risultati
In questo articolo, sono stati confrontati i risultati di entrambi i protocolli di induzione. I diagrammi di entrambi i protocolli di induzione sono illustrati in Figura 2A,C. In entrambi i protocolli, la valutazione è stata eseguita al microscopio ottico e le immagini sono state analizzate con ImageJ. Le hDPSC sono state in grado di formare strutture simili a colonie dal primo giorno di induzione in entrambi i protocolli di induzione. La morfologia della colonia era rotonda.......
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Discussione
Ottenere una maggiore produzione di IPC da MSC svolge un ruolo essenziale nella terapia del diabete. I passaggi critici del protocollo integrativo si basano sulla qualità delle cellule da utilizzare per la trasduzione e sulla qualità delle cellule trasdotte. Alcuni requisiti cellulari che dovrebbero essere controllati per una trasduzione di successo stanno garantendo la salubrità cellulare, la gestione della banca cellulare e le cellule sono in uno stato mitoticamente attivo. Inoltre, anche il monitoraggio della vitalità.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
SK, WR e QDL sono stati supportati dall'Unità di ricerca sulle cellule staminali veterinarie e la bioingegneria, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO e PP sono stati supportati da Chulalongkorn Academic Advancement nel suo progettodel 2 ° secolo. CS è stato supportato da una sovvenzione di supporto alla ricerca della Facoltà di Scienze Veterinarie, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University e Government Research Fund.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | Piatto 15240062 di coltura Corning | |
| 60 mm trattato con TC | Corning® | ||
| Dulbecco' s Medium Eagle modificato (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in polvere, pH 7,4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Una confezione viene utilizzata per preparare 1 L di soluzione PBS con |
| tripsina-EDTA DDI sterile (0,25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrier PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Filtro centrifugo Ultra-15 | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| umano pWPT-PDX1 plasmide | Addgene | 12256 | Regalo da Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Unità filtro per |
| siringa Addgene_12256 Millex-HV, 0,45 µ m | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmide | Addgene | 12259 | Dono di Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Reagente per Infezione / Trasfezione da Polibrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmide | Addgene | 12260 | Dono di Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Protocollo di induzione in tre fasi | |||
| Activin A Proteina umana ricombinante | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoetanolo | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Albumina sierica bovina (BSA, frazione di Cohn V, priva di acidi grassi) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Peptide simile al glucagone (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulina-transferrina-selenio (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Aminoacidi non essenziali (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Piatto per colture cellulari non trattate, 60 mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Butirrato di sodio | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurina | Sigma-Aldrich | T0625 |
Riferimenti
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al.
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Ristampe e permessi
