Questo protocollo descrive i passaggi per la creazione di un modello di coniglio con due aneurismi digeriti con elastasi con emodinamica diversa (moncone e costellazione di biforcazione). Ciò consente la sperimentazione di nuovi dispositivi endovascolari in aneurismi con diverse condizioni di angioarchitettura ed emodinamica all'interno di un singolo animale.
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Articolo metodologico
Creazione di due aneurismi digeriti con elastasi sacculare con emodinamica diversa in un coniglio
In questo articolo
Sommario
Abstract
Modelli animali preclinici con caratteristiche emodinamiche, morfologiche e istologiche vicine agli aneurismi intracranici umani svolgono un ruolo chiave nella comprensione dei processi fisiopatologici e nello sviluppo e sperimentazione di nuove strategie terapeutiche. Questo studio mira a descrivere un nuovo modello di aneurisma del coniglio che consente la creazione di due aneurismi sacculari digeriti con elastasi con diverse condizioni emodinamiche all'interno dello stesso animale.
Cinque coniglie bianche neozelandesi femmina con un peso medio di 4,0 (± 0,3) kg e un'età media di 25 (±5) settimane sono state sottoposte a creazione di monconi microchirurgici e aneurisma di biforcazione. Un aneurisma (moncone) è stato creato dall'esposizione dell'arteria carotide comune destra (CCA) alla sua origine nel tronco brachiocefalico. Una clip temporanea è stata applicata all'origine CCA e un'altra, 2 cm sopra. Questo segmento è stato trattato con un'iniezione locale di 100 U di elastasi per 20 minuti. Un secondo aneurisma (biforcazione) è stato creato suturando una sacca arteriosa trattata con elastasi nell'anastomosi end-to-side del CCA destro al CCA sinistro. La pervietà è stata controllata mediante angiografia a fluorescenza immediatamente dopo la creazione.
La durata media dell'intervento è stata di 221 min. La creazione di due aneurismi nello stesso animale ha avuto successo in tutti i conigli senza complicazioni. Tutti gli aneurismi sono stati brevettati immediatamente dopo l'intervento chirurgico ad eccezione di un aneurisma di biforcazione, che ha mostrato una reazione tissutale estrema dovuta all'incubazione dell'elastasi e una trombosi intraluminale immediata. Non è stata osservata mortalità durante l'intervento chirurgico e fino a un mese di follow-up. La morbilità era limitata a una sindrome vestibolare transitoria (un coniglio), che si riprendeva spontaneamente entro un giorno.
Dimostrata qui per la prima volta è la fattibilità della creazione di un modello di coniglio a due aneurismi con caratteristiche emodinamiche del moncone e della biforcazione e condizioni di parete altamente degenerate. Questo modello consente lo studio del decorso naturale e delle potenziali strategie di trattamento sulla base della biologia dell'aneurisma in diverse condizioni di flusso.
Introduzione
L'aneurisma intracranico è una condizione grave con un tasso di mortalità dopo la rottura che raggiunge il 50% e disabilità a lungo termine nel 10-20% dei pazienti1. L'ultimo decennio ha visto un rapido sviluppo di opzioni di trattamento endovascolare ma, allo stesso tempo, anche un aumento del tasso di recidiva con fino al 33% di ricanalizzazione dell'aneurisma dopo avvolgimento 2,3. Per comprendere meglio la fisiopatologia alla base dell'occlusione e della ricanalizzazione dell'aneurisma, nonché per lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi dispositivi endovascolari, vi è attualmente la necessità di modelli preclinici affidabili le cui caratteristiche emodinamiche, morfologiche e istologiche imitino quelle degli aneurismi intracranici umani 4,5,6 . Ad oggi, non esiste un modello definito come standard per la sperimentazione preclinica e una vasta gamma di specie e tecniche sono disponibili per i ricercatori 7,8.
Tuttavia, il coniglio è una specie di particolare interesse a causa delle dimensioni e delle somiglianze emodinamiche tra le sue arterie del collo e i vasi cerebrali umani, nonché i suoi profili di coagulazione e trombolisi simili. Diversi modelli con aneurismi sacculari digeriti con elastasi sulle arterie carotidi comuni (CCA) hanno mostrato somiglianze qualitative e quantitative con gli aneurismi intracranici umani in termini di condizioni di flusso, caratteristiche geometriche e caratteristiche della parete 9,10,11,12. Questo studio mira a descrivere una tecnica per creare un nuovo modello di aneurisma di coniglio con aneurismi digeriti sia dal moncone che dalla biforcazione nello stesso animale. Le tecniche chirurgiche si ispirano a quelle di Hoh et al.13 e Wanderer et al.14 con lievi modifiche per fornire una buona standardizzazione e riproducibilità e per garantire bassa mortalità e morbilità.
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Protocollo
NOTA: L'esperimento è stato approvato dal Comitato locale per la cura degli animali del Canton Berna, Svizzera (numero di domanda BE108/16), e tutte le cure e le procedure degli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e i principi 3R15,16. I dati sono riportati secondo le linee guida ARRIVE. La gestione perioperatoria è stata condotta da un anestesista veterinario certificato. Per lo studio, le femmine di coniglio bianco neozelandese, con un peso medio di 4,0 (± 0,3) kg e un'età media di 25 (±5) settimane, sono state alloggiate a una temperatura ambiente di 22-24 ° C con un ciclo luce/buio di 12 ore con libero accesso ad acqua, pellet e fieno.
1. Fase pre-chirurgica e anestesia
- Eseguire un esame clinico come raccomandato dall'Associazione degli anestesisti veterinari e dall'European and American College of Veterinary Anesthesia and Analgesia per confermare che i conigli sono sani pesando ogni animale, valutando la mucosa, documentando il tempo di ricarica capillare e la qualità del polso ed eseguendo un'auscultazione polmonare e cardiaca e una palpazione addominale.
- Sulla base del risultato clinico, attribuire una classificazione dell'American Society of Anesthesiologists (ASA) a ciascun coniglio17. Eseguire interventi chirurgici solo su animali con un punteggio ASA I.
- Rasare entrambe le orecchie esterne e applicare la crema prilocaina-lidocaina sulle arterie e le vene auricolari. Ottenere una sedazione profonda con una combinazione di ketamina 20 mg / kg, dexmedetomidina 0,1 mg / kg e metadone 0,3 mg / kg iniettato per via sottocutanea (SC). Lasciare gli animali indisturbati per 15 min. Dare un'ossigenazione supplementare (3 L / min) attraverso una maschera facciale allentata e monitorare con un pulsossimetro.
- Posizionare una cannula da 22 G nell'arteria centrale auricolare sinistra e in una vena auricolare. Indurre l'anestesia generale con propofol 1-2 mg/kg per via endovenosa (IV) fino all'effetto (perdita del riflesso di deglutizione). Procedere con l'intubazione endo-tracheale tramite un tubo di silicone (diametro interno 3 mm).
- Rasare la fronte per posizionare i sensori elettroencefalografici pediatrici (EEG). Rasare il campo chirurgico e iniettare ropivacaina cloridrato 0,75% per via intradermica.
- Posizionare il coniglio sul tavolo operatorio in posizione dorsale, installare il monitoraggio completo e collegare il tubo endo-tracheale a un sistema di cerchio pediatrico a bassa resistenza. Mantenere l'anestesia con la somministrazione di isoflurano nell'ossigeno, mirando a una concentrazione massima di fine marea (Et) dell'1,3%.
- Fornire un'infusione continua di lattato di suoneria 5 ml/kg/h attraverso l'accesso venoso. Garantire il monitoraggio clinico e strumentale fino all'estubazione mediante pulsossimetria, doppler e pressione sanguigna invasiva, elettrocardiogramma a 3 derivazioni, EEG, temperatura rettale, gas inspirati ed espirati.
- Disinfettare il campo chirurgico con iodio povidone dal manubrium sterni agli angoli della mascella e applicare il drappeggio sterile. Durante l'intervento chirurgico, fornire analgesia con lidocaina (infusione a velocità costante (CRI) di 50 μg / kg / min) e fentanil (CRI di 3-10 μg / kg / h). Eseguire la ventilazione spontanea o assistita. Consentire l'ipercapnia permissiva.
- Eseguire almeno un'analisi dei gas del sangue arterioso durante l'intervento chirurgico. In caso di ipotensione (pressione arteriosa media inferiore a 60 mmHg), trattarla con noradrenalina, titolata fino all'effetto. Utilizzare una piastra riscaldante o un sistema di riscaldamento ad aria forzata per prevenire l'ipotermia (obiettivo: temperatura rettale 37,5-38,5 °C).
NOTA: Poiché la pressione arteriosa invasiva viene misurata all'arteria dell'orecchio sinistro, il taglio del CCA sinistro interromperà il flusso sanguigno e sopprimerà la curva. La pressione arteriosa deve quindi essere misurata con tecnica Doppler fino alla riapertura del vaso.
2. Chirurgia
- Avvicinarsi
- Fare un'incisione cutanea mediana dall'osso ioide fino a un punto caudale di 1,5 cm al manubrium sterni con un bisturi. Preparare il tessuto sottocutaneo e grasso dall'incisione mediale mentre si esegue un'emostasi meticolosa.
- Liberare il muscolo sternocefalo dal tessuto connettivo aderente e applicare la lidocaina localmente (2-4 mg / kg, preferire la lidocaina 1%) per evitare il mioclono. Esporre il CCA destro medialmente del muscolo sternocefalo e tenerlo bagnato con tamponi bagnati.
- Ora prepara le parti laterali e prossimali del muscolo sternocefalo e ritrailo medialmente con un cappio vascolare per esporre il CCA. Identificare la vena giugulare esterna e proteggerla con un micro tampone bagnato.
- Sezionare attentamente il tessuto connettivo lungo il CCA prossimale fino alla biforcazione del tronco brachiocefalico per esporre l'arteria. In presenza di piccoli rami provenienti dall'arteria, coagularli con il cauterizzatore.
NOTA: Fare attenzione ad evitare danni ai nervi.
- Creazione di aneurisma del moncone e raccolta dei tessuti per l'aneurisma della biforcazione
- Prima di tagliare il CCA destro, misurare il tempo anti-coagulazione (ACT) e somministrare eparina al sodio (80 EI/kg) per via sistemica attraverso la vena dell'orecchio (eseguita dal team di anestesia) per evitare eventi tromboembolici.
- Ora applica 2 clip temporanee: la prima all'origine del CCA e la seconda a 2 cm distali da esso (Figura 1A). Posizionare un tampone di gomma sotto il recipiente e risciacquare con papaverina HCL (40 mg / ml; 1: 1 sciolto in soluzione salina allo 0,9%) per la vasodilatazione.
- Rimuovere accuratamente l'avventizia usando microforbici. Eseguire un'arteriotomia sotto la clip distale con un catetere IV da 22 G e inserire il catetere caudalmente fino alla clip prossimale (Figura 1A,B).
- Lavare il segmento per via intraluminale con NaCl eparinizzato (500 U/100 mL in soluzione salina allo 0,9%) fino a quando non c'è sangue visibile, e infine fissare il catetere con una legatura (4-0). Ora, attraverso il catetere, iniettare 0,1-0,2 ml di elastasi (100 UI precedentemente disciolte in 5 ml di Tris-Buffer) nel segmento arterioso e incubare per 20 minuti (Figura 1B).
- Iniziare con la dissezione sul lato sinistro per esporre il CCA sinistro (vedere paragrafo 2.3). Dopo 20 minuti di tempo di incubazione con elastasi, eliminare la soluzione di elastasi e cambiare la siringa per sciacquare il segmento dell'arteria circa 10 volte con lo 0,9% di NaCl.
- Applicare 2 legature (6-0): la prima 5 mm distale di clip prossimale e la seconda appena prossimale, sotto l'arteriotomia (Figura 1C). Tagliare il vaso ~ 3 mm sopra la prima legatura e ancora una volta tra la seconda legatura e la clip distale. Conservare questo innesto autologo in una soluzione eparinizzata (500 U/100 mL in soluzione salina allo 0,9%) fino alla creazione dell'aneurisma della biforcazione (Figura 1D). Infine, aprire con attenzione la prima clip prossimale e misurare l'aneurisma (lunghezza, larghezza e profondità).
- Creazione di aneurisma della biforcazione
- Preparare il lato sinistro sezionando medialmente il muscolo sternocefalo per esporre ~ 2 cm del CCA sinistro. Applicare la lidocaina localmente sul muscolo per evitare il mioclono.
- Sottoporgere l'arteria carotide con una palla di garza e un piccolo tampone con un pezzo di guanto. Applicare un po 'di papaverina. HCl topicamente (40 mg/ml; 1:1 disciolto in soluzione salina allo 0,9%). Continuare a lavorare sotto vista microscopica: preparare la sacca dell'aneurisma e rimuovere l'avventizia. Misurare la sacca dell'aneurisma (lunghezza, larghezza, profondità).
- Lavare la parte aperta del CCA destro con NaCl eparinizzato e, se necessario, sostituire la clip per avere ~ 1 cm per consentire manipolazioni libere per la sutura. Rimuovere accuratamente l'avventizia e praticare un'incisione longitudinale di ~ 2 mm lateralmente nel moncone del CCA destro.
- Ora applica due clip temporanee sul CCA sinistro per delimitare un segmento di ~ 1 cm e rimuovere l'avventizia in mezzo. Eseguire un'arteriotomia con un ago da 23 G. Lavare il segmento con NaCl eparinizzato (500 U/100 mL in soluzione salina allo 0,9%). Ingrandire l'arteriotomia usando microforbici a ~4-5 mm per consentire la sutura del CCA destro e della sacca dell'aneurisma (Figura 1E). Irrare i vasi durante l'intera procedura di sutura e proteggerli con micro swap umidi.
- Eseguire l'anastomosi con sutura 9-0 non riassorbibile.
- Suturare la parete posteriore prossimale della carotide destra smussata con 5 punti, a partire dal bordo prossimale dell'arteriotomia sul CCA sinistro. Quindi, suturare il retro della sacca dell'aneurisma con 4-5 punti, a partire dal bordo distale dell'arteriotomia sul CCA sinistro.
- Continuare con il dorso distale a livello dell'incisione della bocca di pesce per suturare con il dorso verticale dell'innesto di aneurisma con 3 punti. Suturare il lato anteriore dell'incisione della bocca di pesce con 3 punti, iniziando verso l'alto e spostandosi verso il basso.
- Finire con la sutura anteriore tra il CCA sinistro e il lato anteriore dell'innesto di aneurisma e CCA destro con ~ 6 punti. Prima di terminare l'anastomosi, sciacquare i vasi con soluzione salina eparinizzata allo 0,9% per via intraluminale.
- Prima di rimuovere il morsetto, misurare ancora una volta il tempo di anticoagulazione (ACT) e somministrare una dose adattata di eparina per via sistemica (target: 2-3 volte l'ACT basale).
- Rimuovere la clip sul CCA destro mentre si esercita una certa pressione sull'anastomosi con micro tamponi per l'emostasi. Quindi, continua rimuovendo la clip distale dal CCA sinistro. Se non c'è sanguinamento maggiore, continuare con l'estrazione della clip prossimale sul CCA sinistro, per consentire il flusso sanguigno. Se c'è qualche sanguinamento dall'anastomosio, applicare una certa pressione con la palla di garza e il tampone; Attendere un paio di minuti. Se persiste, sostituisci le clip ed esegui le ricuciture.
NOTA: Una perdita di sangue superiore a 20-30 ml può compromettere la fase di recupero.
- Controllo e documentazione della pervietà
- Dopo aver aperto tutti i vasi, documentare fotograficamente i risultati e misurarli (Figura 1F e Figura 2A,B).
- Confermare il ripristino del flusso nel CCA distale attraverso la curva invasiva della pressione arteriosa (misurata all'arteria dell'orecchio, un ramo diretto della carotide esterna), che dovrebbe anche tornare alla normalità.
- Eseguire l'angiografia a fluorescenza somministrando 1 ml di fluoresceina IV, utilizzando 2 filtri passa-banda, una videocamera e un riflettore per biciclette. Cfr. pubblicazioni precedenti per la descrizione dell'intera procedura18,19.
- Chiusura
- Riadattare il cuscinetto adiposo sull'anastomosi e suturarlo con una sutura riassorbibile 4-0. Infine sutura sottocute e pelle con punti singoli utilizzando sutura riassorbibile 4-0.
3. Fase postchirurgica
- Alla fine dell'intervento, interrompere l'isoflurano e l'analgesia sistemica senza reversione al fine di mantenere l'effetto analgesico. Assicurarsi che il controllo del riflesso di deglutizione sia tornato prima di eseguire l'estubazione tracheale.
- Somministrare meloxicam 0,5 mg/kg IV per assicurare l'analgesia, aspirina (ASS) 10 mg/kg IV per prevenire eventi trombotici immediati, vitamina B12 100 μg SC e clamoxyl 20 mg/kg IV come profilassi antibiotica.
- Fornire ossigenazione e riscaldamento supplementari fino a quando il coniglio riacquista spontaneamente la recumenza sternale. Eseguire l'analgesia di salvataggio con metadone se si osserva qualsiasi segno di dolore. Eseguire follow-up postoperatorio e cura 4 volte al giorno per i primi 3 giorni preoperatori, in conformità con le linee guida per la valutazione e la gestione del dolore nei roditori e nei conigli23,24.
- Garantire l'analgesia postoperatoria con cerotto di fentanil (12 μg/h) applicato sull'orecchio esterno, meloxicam 1x/SC per 3 giorni e metadone come terapia di salvataggio, insieme a un foglio di valutazione per la valutazione del dolore (file supplementare).
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Risultati
La creazione di un moncone e di un aneurisma della biforcazione ha avuto successo in tutti e 5 i conigli bianchi della Nuova Zelanda senza complicazioni intraoperatorie. Non è stata osservata mortalità durante l'intervento chirurgico o durante il periodo di follow-up di 24 ± 2 giorni. Un coniglio ha avuto complicazioni postoperatorie con una sindrome vestibolare e una cecità del lato destro. L'animale si è ripreso completamente e spontaneamente dopo 24 ore. Questa complicanza non ha interferito con le sue normali attivit...
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Discussione
La tecnica più comune per la creazione di aneurismi prevede la creazione di un aneurisma del moncone all'origine del CCA destro, attraverso un metodo aperto o endovascolare. Il modello è stato validato per essere un aneurisma stabile non in crescita che rimane aperto con il tempo20,21. La seconda tecnica possibile prevede la creazione microchirurgica di un aneurisma della biforcazione arteriosa anastomosi il CCA destro su quello sinistro e suturando una sacca per...
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Prof. Hans Rudolf Widmer, il Dr. Luca Remonda, e il Prof Javier Fandino per il loro supporto scientifico e contributo tecnico a questo lavoro. Un ringraziamento speciale a Olgica Beslac per i suoi consigli durante le procedure e Kay Nettelbeck per la sua assistenza. Si ringraziano inoltre Daniela Casoni DVM, PhD e med. vet. Luisana Garcia, PD Dr Alessandra Bergadano, e Dr Carlotta Detotto per il loro supporto veterinario dedicato.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sutura riassorbibile 4-0 | Ethicon Inc., USA | VCP292ZH | |
| Sutura riassorbibile 4-0 | Ethicon Inc., USA | VCP304H | |
| Sutura non assorbibile 6-0 | B. Braun, Germania | C0766070 | |
| Adrenaline | Amino AG | 1445419 | qualsiasi |
| Amiodarone | Helvepharm AG | 5078567 | qualsiasi |
| macchina per anestesia | ger | qualsiasi altra | |
| aspirina | Sanofi-Aventis (Suisse) SA | 622693 | qualsiasi generico |
| Atropine | Labatec Pharma SA | 6577083 | qualsiasi |
| generico filtro passa-banda blu | Thorlabs | FD1B | qualsiasi altro |
| filtro passa-banda verde | Thorlabs | FGV9 | qualsiasi altro |
| clip per vasi Biemer (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Svizzera | FD560R | qualsiasi altro |
| Pinza | qualsiasi altro | ||
| Indice bispettrale (neonatale) | qualsiasi altro | ||
| Bracciale per la pressione sanguigna (neonatale) | qualsiasi altro | ||
| Bicicletta spotlight | qualsiasi altro | ||
| Clamoxyl | GlaxoSmithKline AG | 758808 | qualsiasi generico |
| Dexmedetomidina | Ever Pharma | 136740-1 | qualsiasi |
| Elastasi | Sigma Aldrich | E7885 | |
| Elettrodi | |||
| Efedrina | Amino AG | 1435734 | |
| Esmolol | OrPha Swiss GmbH | 3284044 | |
| Fentanyl (uso endovenoso) | Janssen-Cilag AG | 98683 | |
| Fentanyl (transdermico) | Mepha Pharma AG | 4008286 | |
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | |
| Fragmin | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 1906725 | |
| Termoforo o sistema | |||
| Soluzione: isotonica di cloruro di sodio (0,9%) | Fresenius KABI | 336769 | |
| Ketamina | Divaricatore | ||
| Approach | |||
| Micro-pinze | curvo Ulrich Swiss, Svizzera | U52-015-15 | |
| Micro-pinze dritto 2x | Ulrich Swiss, Svizzera | U52-010-15 | |
| Microforbici | Ulrich Swiss , Svizzera | U52-327-15 | |
| Midazolam | Accord Healthcare AG | 7752484 | |
| Ago 23 G | arteriotomia | ||
| Porta ago | |||
| O2-maschera facciale | |||
| Microscopio operatorio | Wild Heerbrugg | ||
| Papaverin | Bichsel | applicazione topica | |
| Povidone iodio | Mundipharma Medical Company | qualsiasi generico | |
| Prilocaina-lidocaina crème | Emla | ||
| Propofol | B. Braun Medical AG, Svizzera | Anestesia generale | |
| Pulsossimetro | |||
| Sonda di temperatura rettale (neonatale) | |||
| Ringer Lattato | Bioren Sintetica SA | Infusione | |
| Ropivacain | Aspen Pharma Schweiz GmbH | 1882249 | Anestesia locale |
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | |
| Rasoio | |||
| Pinze | |||
| Spalmatore | |||
| spugna in acciaio inossidabile | |||
| Micro tamponi | |||
| Stetoscopio | |||
| Telo | chirurgico | ||
| chirurgiche | |||
| Siringhe da 1 mL, 2 mL e 5 mL | |||
| Tris-Buffer | Sigma Aldrich | 93302 | Soluzione di elastasi |
| Applicatore di clip vascolari | B. Braun, Germania | FT495T | |
| Catetere venoso e arterioso Ansa | |||
| Approccio | |||
| videocamera o smartphone | |||
| Vitarubin | Streuli Pharma AG | 6847559 | |
| Yasargil titan clip standard (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Svizzera | FT242T |
Riferimenti
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