Questo protocollo evidenzia un metodo per valutare rapidamente la biocompatibilità di un inchiostro biomateriale idrogel composito di nanocellulosa cristallina (CNC)/agarosio con mastociti derivati dal midollo osseo di topo in termini di vitalità cellulare ed espressione fenotipica dei recettori della superficie cellulare, Kit (CD117) e recettore IgE ad alta affinità (FcεRI).
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Articolo metodologico
Fabbricazione di un inchiostro biomateriale di agarosio incorporato in nanocellulosa cristallina per la coltura di mastociti derivati dal midollo osseo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La bioprinting tridimensionale (3D) utilizza compositi a base di idrogel (o inchiostri di biomateriali) che si depositano in un modello, formando un substrato su cui vengono depositate le cellule. Poiché molti inchiostri di biomateriali possono essere potenzialmente citotossici per le cellule primarie, è necessario determinare la biocompatibilità di questi compositi idrogel prima del loro utilizzo in costosi processi di ingegneria tissutale 3D. Alcuni metodi di coltura 3D, tra cui il bioprinting, richiedono che le cellule siano incorporate in una matrice 3D, rendendo difficile estrarre e analizzare le cellule per i cambiamenti nella vitalità e nell'espressione dei biomarcatori senza provocare danni meccanici. Questo protocollo descrive come prova di concetto, un metodo per valutare la biocompatibilità di un composito di agarosio incorporato nella nanocellulosa cristallina (CNC), fabbricato in un sistema di coltura a 24 pozzetti, con mastociti derivati dal midollo osseo di topo (BMMC) utilizzando saggi citometrici a flusso per la vitalità cellulare e l'espressione di biomarcatori.
Dopo 18 ore di esposizione alla matrice CNC/agarosio/D-mannitolo, la vitalità del BMMC è rimasta inalterata misurata dalla permeabilità allo ioduro di propidio (PI). Tuttavia, le BMMC coltivate sul substrato CNC/agarosio/D-mannitolo sembravano aumentare leggermente la loro espressione del recettore IgE ad alta affinità (FcεRI) e del recettore del fattore delle cellule staminali (Kit; CD117), anche se questo non sembra dipendere dalla quantità di CNC nel composito bioink. La fattibilità dei BMMC è stata anche valutata a seguito di un'esposizione a intervalli di idrogel fabbricati da un inchiostro di biomateriale commerciale composto da nanocellulosa fibrillare (FNC) e alginato di sodio utilizzando un bioprinter di estrusione 3D. Per un periodo di 6-48 ore, i substrati FNC/alginato non hanno influenzato negativamente la vitalità delle BMMC come determinato mediante citometria a flusso e saggi di microtitolazione (XTT e lattato deidrogenasi). Questo protocollo descrive un metodo efficiente per esaminare rapidamente la compatibilità biochimica degli inchiostri biomateriali candidati per la loro utilità come scaffold 3D per la semina post-stampa con i mastociti.
Introduzione
Il recente interesse per i sistemi di coltura 3D e il bioprinting 3D ha focalizzato l'attenzione su idrogel e compositi idrogel. Questi compositi fungono da biomimetica viscosa ma porosa e possono essere composti fino al 99% di contenuto di acqua in peso, che è paragonabile ai tessuti biologici1,2,3. Queste caratteristiche dei compositi idrogel consentono quindi la crescita delle cellule senza influire sulla loro vitalità e funzione. Uno di questi compositi è la nanocellulosa cristallina (CNC), che è stata utilizzata come materiale di rinforzo nei compositi idrogel, negli sca....
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Protocollo
NOTA: Questo protocollo è composto da cinque sezioni: (1) isolamento del midollo osseo di topo e differenziazione dei mastociti derivati dal midollo osseo del topo (BMMC), (2) fabbricazione di substrati di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo in un sistema a 24 pozzetti e coltura di BMMC sui substrati, (3) rimozione di BMMC dai substrati di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo e analisi della vitalità e dell'espressione del biomarcatore mediante citometria a flusso, (4) Bioprinting 3D di scaffold di idrogel da un inchiostro di biomateriale composito di nanocellulosa fibrillare (FNC)/alginato di sodio disponibile in commercio e (5) coltura di BMMC su scaffold di idrogel FNC/a....
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Risultati
Una delle caratteristiche più cruciali di un inchiostro biomateriale di successo o di un substrato di coltura è quella della biocompatibilità. In primo luogo, il substrato non deve indurre la morte cellulare. Esistono diversi metodi citometrici a microtitolazione e a flusso per quantificare la vitalità cellulare e la necrosi; tuttavia, questi metodi non sono suscettibili di analizzare le cellule incorporate all'interno di una matrice di idrogel. In questo protocollo, la limitazione di cui sopra viene aggirata seminando i.......
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Discussione
La fabbricazione di tessuti biomimetici 3D richiede la riuscita fusione del bioink, che imita i componenti della matrice extracellulare, con i componenti cellulari per creare analoghi fisiologici dei tessuti in vivo . Ciò richiede l'uso di cellule primarie, e non di cellule trasformate, quando si fabbricano tessuti biomimetici fisiologici. Le cellule immunologiche primarie, come i mastociti, tuttavia, sono particolarmente suscettibili agli effetti citotossici e ai cambiamenti fenotipici che possono essere provoc.......
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Dichiarazioni
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Research Council Canada e Alberta Innovates.
Ringraziamenti
Ringraziamo Alberta Innovates per aver fornito il CNC e Ken Harris e Jae-Young Cho per la loro consulenza tecnica durante la preparazione della matrice CNC / agarosio / D-mannitolo. Ringraziamo anche Ben Hoffman, Heather Winchell e Nicole Diamantides per la loro consulenza tecnica e supporto con la configurazione e la calibrazione della bioprinter 3D INKREDIBLE+.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| A | |||
| Acido acetico (glaciale) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarosio (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Controllo dell'isotipo IgG del criceto armeno, APC (clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoetanolo | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenina dinucleotide sale sodico (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Siringa (punta Luer-Lok) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Ago 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 pozzetti Multipiatto | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 pozzetti | Multipiatto Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Pallone ventilato | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Armadio di biosicurezza Classe II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Frazione V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 topi | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Anticorpo monoclonale, PE (clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 cartucce da 3 ml) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Flacone sterile 1 x 60 mL | cellink llc | ||
| CELLINK Cartucce vuote 3cc con estremità e tappi di punta | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare per PC | CELLINK LLC | Versione 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Ugelli conici sterili standard per bioprinting 22G | CELLINK LLC | ||
| Ugelli conici sterili standard per bioprinting CELLINK 25G | CELLINK LLC | ||
| Ugelli conici sterili per bioprinting standard CELLINK 27G | CELLINK LLC | ||
| Kit di proliferazione cellulare II (XTT) (Roche) | Centrifuga Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| (da banco) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germania | 9040-0113 | |
| Citometro a flusso CytoFLEX | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon Provette coniche in polistirene da 15 mL, | Corning | ||
| Falcon da 50 mL, | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha, APC (clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Siero fetale bovino (FBS), qualificato, calore inattivato | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Versione 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Versione 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Migliorato VWR | 15170-208 | ||
| HEPES Sale di sodio | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolio cloruro (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutammina 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| L-lattato di litio | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Aminoacidi non essenziali 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-metossi-5-metilfenazinio metil solfato (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microprovette (1,7 mL trasparente) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microprovette (2,0 mL trasparente) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (per la produzione di acqua ultrapura MilliQ) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Unità filtrante a flusso rapido da 90 mm (dimensione dei pori 0,2 mm, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Filtro per siringa Nalgene (0,2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillina Streptomicina 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7,4, senza calcio/magnesio, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Ioduro di propidio, 1,0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566< | |
| strong>R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Ricombinante Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutammina (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 pozzetti base rotonda PS micropiastra per test trasparente (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodio azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Piruvato di sodio (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-ammino-2(idrossimetil)-1,3-propandiolo) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| soluzione di Trypan Blue (0,4%, per microscopia) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| Spettrofotometro per micropiastre VARIOSKAN LUX (Tipo: 3020) | Thermo Fisher Scientific VLBL00D0 |
Riferimenti
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications.
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Ristampe e permessi
