Articolo metodologico

Colorazione del Citoplasmatico Ca2+ con Fluo-4/AM in Polpa di Mela

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DOI:

10.3791/62526

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6 novembre 2021

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1College of Horticulture, Qingdao Agricultural University

In questo articolo

Sommario

Protoplasti isolati di cellule di polpa di mela sono stati caricati con un reagente fluorescente di calcio per rilevare la concentrazione citoplasmatica di Ca2+.

Abstract

Cytosolic Ca2+ svolge un ruolo chiave nello sviluppo delle piante. L'imaging del calcio è il metodo più versatile per rilevare i cambiamenti dinamici nel Ca2+ nel citoplasma. In questo studio, abbiamo ottenuto protoplasti vitali di cellule pulpare mediante idrolisi enzimatica. I protoplasti isolati sono stati incubati con il reagente fluorescente a piccola molecola (Fluo-4/AM) per 30 minuti a 37 °C. Le sonde fluorescenti hanno colorato con successo il catosolico Ca2+ ma non si sono accumulate nei vacuoli. La3+,un bloccante dei canali Ca2+, ha diminuito l'intensità della fluorescenza citoplasmatica. Questi risultati suggeriscono che Fluo-4 / AM può essere utilizzato per rilevare cambiamenti nel Ca2 + citosolico nella polpa del frutto. In sintesi, presentiamo un metodo per isolare efficacemente i protoplasti dalle cellule carnise del frutto e rilevare Ca2+ caricando un reagente fluorescente di calcio a piccola molecola nel citoplasma delle cellule della polpa.

Introduzione

Ca2+ svolge un ruolo importante nella trasduzione del segnale vegetale e nel metabolismo1,2. Inoltre, regola i tratti di qualità della frutta3,4, tra cui durezza, contenuto di zucchero e suscettibilità a disturbi fisiologici durante la conservazione5,6. Il Ca2+ citoplasmatico svolge un ruolo importante nella trasduzione del segnale e regola la crescita e lo sviluppo delle piante7. Il disturbo dell'omeostasi cellulare del calcio può indurre la fossa amara nelle mele8, la malattia delle macchie marroni nelle pere9e il marciume ombelicale nei pomodori10, influenzando la qualità della frutta e causando gravi perdite economiche3,11. L'imaging del calcio ha una risoluzione spaziale e temporale sufficiente ed è un metodo importante per osservare la dinamica di Ca2+ nelle cellule viventi12,13.

Allo stato attuale, ci sono due metodi principali per l'imaging intracellulare del calcio nelle cellule vive: uno impiega sonde fluorescenti chimiche a piccole molecole14e l'altro è il sensore di codifica genica (GECI)15,16. Data la difficoltà di stabilire un sistema transgenico stabile negli alberi da frutto e uno sviluppo più lungo dei frutti, GECIS non è adatto per l'imaging a fluorescenza Ca2+ della frutta.

Le sonde fluorescenti a piccole molecole come Fluo-4 / AM hanno un vantaggio particolare: la loro forma di estere AM (derivato dell'estere acetoximetilico permeabile alle cellule) può essere facilmente caricata in massa nelle cellule viventi senza la necessità di trasfezione, il che la rende flessibile, rapida e non citotossica17. Fluo-4 / AM potrebbe essere caricato con successo nel tubo pollinico di Pyrus pyrifolia18 e Petunia,19 così come nelle cellule di guardia20 e nei capelli radicali di Arabidopsis21.

Allo stato attuale, ci sono pochi rapporti sulla colorazione a fluorescenza di calcio delle cellule della polpa22. Come importante elemento minerale, il calcio svolge un ruolo chiave nella crescita e nel controllo di qualità dei frutti degli alberi come le mele. I meli sono riconosciuti a livello mondiale come un'importante specie economica e le mele sono considerate un alimento sano23. In questo studio, abbiamo ottenuto protoplasti vitali dalla polpa del frutto della mela attraverso l'idrolisi enzimatica e poi caricato reagenti fluorescenti a piccole molecole nel citoplasma per rilevare Ca2 +.

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Protocollo

1. Estrazione di protoplasti

  1. Preparare la soluzione di base: 20 mM CaCl2, 5 mM 2-(N-morfolino)acido etanosolfonico e 0,4 M D-sorbitolo.
    NOTA: il pH della soluzione di base è stato regolato a 5,8 con tampone Tris da 0,1 M, filtrato attraverso filtri solubili in acqua da 0,22 μm e conservato a 4 °C.
  2. Preparare la soluzione enzimatica: Mescolare lo 0,3% (p/v) di Macerozima R-10 e lo 0,5% (p/v) di cellulasi R-10 con la soluzione di base.
  3. Aggiungere 0,5 mL di soluzione enzimatica in un tubo centrifugo da 1,5 mL. Scegli una mela sana e matura. Quindi affettare la polpa in formato 10 x 5 x 1 mm3 (Figura 1A-1C).
  4. Posizionare i pezzi di polpa di frutta di mela in un tubo di centrifuga da 1,5 ml contenente soluzione enzimatica e quindi chiudere il tubo (Figura 1D).
  5. Incubare il tubo a 28 °C per 1 ora, agitando a 70 giri/min in uno shaker al buio.
  6. Lavare i pezzi di polpa. Aspirare tutta la soluzione enzimatica e quindi aggiungere 0,5 ml della soluzione di base.
  7. Centrifugare a 300 x g per 2 minuti a temperatura ambiente.
  8. Per ottenere una sospensione di protoplasto, aspirare la soluzione dal fondo del tubo della centrifuga (Figura 1E).

2. Colorazione a fluorescenza a ioni di calcio a piccola molecola

  1. Preparare la soluzione di carico Fluo-4/AM con 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 e 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS:80 mM Na2HPO4,1,36 M NaCI, 20 mM KH2PO4e 26 mM KCI) in un rapporto 1:1:2.
  2. Aggiungere 1 μL di soluzione di carico Fluo-4/AM a 99 μL della sospensione di protoplasto presente nei tubi della centrifuga da 1,5 mL. Assicurarsi che la concentrazione finale del colorante fluorescente sia di 5 μM. Mescolare la soluzione e quindi chiudere il tubo.
  3. Trattamento La3+: Preparare 100 μM la soluzione La3+ con 98 μL di sospensione protoplasta, 1 μL di 10 mM La3+e 1 μL di soluzione di carico Fluo-4/AM. Mescolare la soluzione e chiudere il tubo.
  4. Incubare per 30 minuti a 37 °C al buio.
  5. Lavare i protoplasti per centrifugazione a 300 x g per 2 minuti a temperatura ambiente. Aspirare 70 μL della soluzione e aggiungere 70 μL della soluzione di base.
  6. Incubare la sospensione di protoplasto a 37 °C per 30 minuti per de-esterificare completamente.
  7. Aspirare 15 μL della sospensione del protoplasto e gocciolare su un vetrino.
  8. Osservare al microscopio a fluorescenza (Figura supplementare S1).
    NOTA: utilizzare una fotocamera a colori con alta sensibilità, ovvero sensore CMOS da 3,2 MP (2048 x 1536) con risoluzione pixel di 3,45 μm.
  9. Selezionare il canale GFP per l'imaging (20x). Impostare la luminosità su 0,5.
    NOTA: l'illuminazione è un cubo di luce a LED ad intensità regolabile con un set di filtri hard-coated integrato. La lunghezza d'onda di eccitazione di Fluo-4/AM è di 490 nm.

3. Saggio di vitalità del protoplasto

  1. Preparare la soluzione madre di fluoresceina diacetato (FDA): Sciogliere FDA in acetone fino a quando la concentrazione finale è di 1 mg/ml.
  2. Preparare la soluzione di lavoro FDA con 1 μL della soluzione stock e 99 μL di acetone.
  3. Aggiungere 1 μL di soluzione di lavoro FDA a 99 μL di sospensione di protoplasto. Mescolare la soluzione tubando su e giù e quindi chiudere il tubo.
    NOTA: La concentrazione finale della FDA è di 100 μg/L.
  4. Macchiare a temperatura ambiente per 5 minuti al buio.
  5. Preparare i vetrini e osservare al microscopio a fluorescenza.
  6. Selezionare il canale GFP per l'imaging (Figura 1F).

4. Analisi delle immagini

  1. Analizza le immagini acquisite utilizzando l'analisi delle immagini e il software per fogli di calcolo (ad esempio, Image-Pro Plus ed Excel 2010).
  2. Selezionare due diametri verticali dai protoplasti per calcolare l'intensità di fluorescenza (Figura supplementare S2). È stata misurata l'intensità di fluorescenza di tutti i protoplasti sotto diversi trattamenti. Per l'elaborazione finale, utilizzare un software di fotoritocco.

5. Analisi statistica

  1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software statistici (Figura supplementare S3). I dati sono presentati in Mean ± SD. Il t-testdello studente è stato utilizzato per analizzare le differenze tra i gruppi sperimentali.

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Risultati

Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo utilizzato il metodo enzimatico per ottenere protoplasti vitali dalla polpa (Figura 1). Alcuni protoplasti avevano vacuoli, mentre altri no. Mentre i protoplasti non hanno mostrato fluorescenza quando l'indicatore fluorescente Ca2 + non è stato caricato in essi. Quando Fluo-4/AM è stato caricato nei protoplasti, il citoplasma, ma non il vacuolo, è diventato fluorescente (Figura 2). Questo risultato ha in...

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Discussione

In questo studio, protoplasti vitali sono stati ottenuti mediante idrolisi enzimatica. Si noti che questo metodo richiede mele fresche. Il presente protocollo consente il rapido isolamento di un gran numero di protoplasti dalla polpa di frutta per l'uso in studi di ricerca. L'applicabilità di questo metodo non è limitata a 'Fuji'; anche i protoplasti della polpa di mela di 'Dounan' e 'Honey Crisp' possono essere estratti attraverso lo stesso protocollo (Figura supplementare S4). La soluzione di protoplas...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con i contenuti di questo articolo.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal progetto di miglioramento delle varietà agricole della provincia di Shandong (2019LZGC007) e dal team di innovazione degli alberi da frutto del moderno sistema tecnologico dell'industria agricola dello Shandong (SDAIT-06-05).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10× soluzione salina tamponata con fosfatoSolarbioP1022PBS (soluzione tamponata con fosfato) è una soluzione tampone fosfato, in grado di fornire un ambiente ionico relativamente stabile e una capacità tampone del pH. È una soluzione salina tampone spesso utilizzata in biologia per il clonaggio molecolare e la coltura cellulare. Il pH è 7,4.
Acido 2-(N-morfolino)etansolfonicoSolarbioM8010Tampone biologico
CaCl2· 2H2OSolarbioC8370Il cloruro di calcio diidrato è una sostanza chimica bianca o grigia, per lo più in forma granulare.
Cellulasi R-10Yakult HonshaMX7352Degradare le pareti cellulari delle piante.
D-sorbitoloSolarbioS8090Ha buone proprietà idratanti, previene l'essiccazione e previene la cristallizzazione di zucchero, sale, ecc.
F-127Thermo Fisher ScientificP6867Pluronic F-127 è un poliolo tensioattivo non ionico (peso molecolare di circa 12500 Dalton), che si è rivelato utile per promuovere la dissoluzione di coloranti insolubili in acqua e altri materiali in mezzi fisiologici.
FDAThermo Fisher ScientificF1303FDA è un substrato di esterasi permesso-cellulare che può fungere da sonda di vitalità che misura sia l'attività enzimatica, necessaria per attivare la sua fluorescenza, sia l'integrità della membrana cellulare, necessaria per la ritenzione intracellulare del loro prodotto fluorescente.
Fluo-4/AMThermo Fisher ScientificF14201L'indicatore di calcio fluorescente verde Fluo-4/AM è una versione migliorata dell'indicatore di calcio Fluo-3/AM. Il Fluo-4/AM si carica più velocemente ed è più luminoso alla stessa concentrazione. Può essere ben eccitato con un laser a ioni argon da 488 nm.
Microscopio a fluorescenzaThermo FisherEVOS Auto 2Osservare l'immagine a fluorescenza.
Macerozyme R-10Yakult HonshaMX7351Degrada il tessuto vegetale per separare le singole cellule.
TrisSolarbioT8060È ampiamente utilizzato nella preparazione di tamponi in esperimenti di biochimica e biologia molecolare.

Riferimenti

  1. Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. Fruit calcium: Transport and physiology. Frontiers in Plant Science. 7, 569(2016).
  2. Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling. Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).
  3. Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening. Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).
  4. Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).
  5. Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. Factors affecting apple fruit firmness--a review. Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).
  6. Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review. New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).
  7. Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions. New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).
  8. Miqueloto, A., et al. Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple. Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).
  9. Kou, X., et al. Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage. Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).
  10. Vinh, T. D., et al. Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth. The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).
  11. Yamane, T. Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees. Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).
  12. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  13. Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. CSH Protocols. 2013 (2), 83(2013).
  14. Hirabayashi, K., et al. Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability. Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).
  15. Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics. Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
  16. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
  17. Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  18. Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs. PLoS One. 11, 0152320(2016).
  19. Suwińska, A., Wasąg, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia. Planta. 245 (5), 909-926 (2017).
  20. Sun, L., et al. NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells. Plant Science. 262, 81-90 (2017).
  21. Niu, Y. F., et al. Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).
  22. Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica. Horticulture Research. 7, 91(2020).
  23. Boyer, J., Liu, R. H. Apple phytochemicals and their health benefits. Nutrition Journal. 3 (1), 5(2004).
  24. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).
  25. Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia. New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).
  26. Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling. PLoS One. 3 (6), 2511(2008).
  27. DeSimone, J. A., et al. Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli. Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).
  28. Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).
  29. Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2. Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).
  30. Li, W., et al. A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium. Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647(2014).
  31. Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature. Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).
  32. Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia. Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).
  33. Wang, Y., et al. Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs. BMC Plant Biology. 10, 53(2010).
  34. Fujimori, T., Jencks, W. P. Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion. Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).

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