Articolo metodologico

Imaging e quantificazione di dendriti neuronali intatti tramite CLARITY Tissue Clearing

DOI:

10.3791/62532

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20 aprile 2021

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1Department of Genetics and Genomics, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

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La morfologia dendritica neuronale è spesso alla base della funzione. In effetti, molti processi patologici che influenzano lo sviluppo dei neuroni si manifestano con un fenotipo morfologico. Questo protocollo descrive un metodo semplice e potente per analizzare i pergole dendritiche intatte e le loro spine associate.

Abstract

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L'attività cerebrale, i segnali elettrochimici passati tra i neuroni, è determinata dai modelli di connettività delle reti neuronali e dalla morfologia dei processi e delle sottostrutture all'interno di questi neuroni. Come tale, gran parte di ciò che è noto sulla funzione cerebrale è sorto insieme agli sviluppi nelle tecnologie di imaging che consentono ulteriori informazioni su come i neuroni sono organizzati e collegati nel cervello. I miglioramenti nella pulizia dei tessuti hanno permesso l'imaging ad alta risoluzione di spesse fette di cervello, facilitando la ricostruzione morfologica e le analisi delle sottostrutture neuronali, come i pergole dendritiche e le spine. In parallelo, i progressi nel software di elaborazione delle immagini forniscono metodi per analizzare rapidamente set di dati di imaging di grandi dimensioni. Questo lavoro presenta un metodo relativamente rapido di elaborazione, visualizzazione e analisi di spesse fette di tessuto neurale etichettato ad alta risoluzione utilizzando la pulizia dei tessuti CLARITY, la microscopia confocale e l'analisi delle immagini. Questo protocollo faciliterà gli sforzi verso la comprensione dei modelli di connettività e delle morfologie neuronali che caratterizzano i cervelli sani e i cambiamenti in queste caratteristiche che sorgono negli stati cerebrali patologici.

Introduzione

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Comprendere l'organizzazione spaziale, i modelli di connettività e la morfologia di strutture biologiche tridimensionali complesse è essenziale per delineare le funzioni di cellule e tessuti specifici. Ciò è particolarmente vero nelle neuroscienze, in cui è stato dedicato un enorme sforzo alla costruzione di mappe neuroanatomiche ad alta risoluzione del sistema nervoso centrale1,2. Un attento esame dei neuroni che compongono queste mappe produce varie morfologie, con connessioni e posizioni che riflettono la funzione di questi diversi insiemi di neuroni3,4

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Protocollo

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Il seguente protocollo segue tutte le linee guida per la cura degli animali per il Baylor College of Medicine.

1. Dissezione e preparazione dei tessuti

  1. Eutanasia del topo con un sovradosaggio di isoflurano mettendo il topo in un contenitore chiuso con un asciugamano imbevuto di isoflurano (o con altri mezzi approvati IUCAC).
  2. Perfondere l'animale transcardicamente utilizzando un ago da 25 G con 10 ml di PBS ghiacciato, seguito da 10 ml di PFA al 4%.
  3. Sezionare la regione del cervello (o tessuto) di interesse.
  4. Posizionare il tessuto sezionato in PFA al 4% durante la notte a 4 °C. Una corretta fissazione....

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Risultati

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Dopo l'acquisizione dell'immagine, la morfologia cellulare rappresentativa è stata analizzata utilizzando statistiche incorporate e classificando gli script all'interno del software di analisi. I dati raccolti (Figura 6A) riflettono che il neurone 2 ha una struttura dendritica più grande con una maggiore densità di spine. Nel complesso, i dati suggeriscono che il neurone 2 ha una struttura dendritica più complessa rispetto al neurone 1. Per corroborare questo risultato, è stata eseguita un'a.......

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Discussione

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Prima dell'avvento delle tecniche contemporanee di pulizia dei tessuti, lo studio della morfologia neuronale consisteva nel sezionamento, nell'imaging e nella ricostruzione di sezioni molto sottili adiacenti. L'uso della pulizia del tessuto elettroforetico in combinazione con l'imaging confocale fornisce una visione libera della morfologia neuronale completa. Dagli alberi dendritici intatti, fino al più piccolo bouton sinaptico, l'imaging e la quantificazione della morfologia neuronale non sono mai stati più fattibili.

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare in questo momento.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare il nucleo virale NRDDC presso l'Istituto neurologico Jan e Dan Duncan per la produzione di AAV e lentivirus utilizzati in questi esperimenti. Inoltre, vorremmo ringraziare il Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine per l'allevamento dei topi e la manutenzione generale dei topi utilizzati. Vorremmo ringraziare l'American Heart Association per il loro sostegno con il numero di premio 20PRE35040011 e BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists per il loro supporto (PJH). Infine, vorremmo ringraziare Logos per aver fornito al nostro laboratorio il sistema di pulizia dei tessuti elettroforetici Logos X-Clarity.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta conica da 15 mLThermo Scientific339650
Ago da 25 g x 1"BD305127
30% acrilammide (No-Bis)National DiagnosticsEC-810
Provetta conica da 50 mLThermo Scientific339653
Soluzione per la pulizia dei tessuti elettroforeticiLoghiC13001
HistodenzSigmaD2158-100G
Kit soluzione idrogelLoghiC1310X
ImarisOxford InstrumentsN/A
Paraformaldeide 16%EMS15710
PBS, 1x, 500 mL, 6 bottiglie/cassafisherMT21040CV
VA-044Wako925-41020
X-CLARITY Sistema di polimerizzazioneLogosC20001
Sistema di pulizia tissutale X-CLARITY IILogosC30001

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
  2. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions o....

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Microscopia confocaleimaging del tessuto cerebraleanalisi delle spine dendritichemorfologia neuronaleanalisi di Shollcolorazione immunoistochimicaadattamento dell indice di rifrazionetessuto tridimensionale

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