Articolo metodologico

Assorbimento di piccole vescicole extracellulari etichettate fluorescenti in vitro e nel midollo spinale

DOI:

10.3791/62537

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23 maggio 2021

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1Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un protocollo per etichettare piccole vescicole extracellulari derivate da macrofagi con coloranti PKH e osservarne l'assorbimento in vitro e nel midollo spinale dopo il parto intratecale.

Abstract

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Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono vescicole da 50-150 nm secrete da tutte le cellule e presenti nei fluidi corporei. Gli sEV trasferiscono biomolecole come RNA, proteine e lipidi dalle cellule donatrici alle cellule accettori, rendendole mediatori chiave di segnalazione tra le cellule. Nel sistema nervoso centrale (SNC), i sEV possono mediare la segnalazione intercellulare, comprese le interazioni neuroimmune. Le funzioni di sEV possono essere studiate monitorando l'assorbimento di sEV etichettati nelle cellule riceventi sia in vitro che in vivo. Questo documento descrive l'etichettatura dei sEV dai mezzi condizionati delle cellule macrofagiCHE RAW 264.7 utilizzando un colorante a membrana PKH. Mostra l'assorbimento di diverse concentrazioni di sEV etichettati in più punti temporali da parte delle cellule Neuro-2a e degli astrociti primari in vitro. Viene anche mostrato l'assorbimento di sEV somministrati per via intratecale nei neuroni del midollo spinale del topo, negli astrociti e nelle microglia visualizzate mediante microscopia confocale. I risultati rappresentativi dimostrano una variazione dipendente dal tempo nell'assorbimento di sEV da parte di cellule diverse, che può aiutare a confermare il successo della consegna di sEV nel midollo spinale.

Introduzione

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Le piccole vescicole extracellulari (sEV) sono vescicole nanodimensionate derivate dalla membrana con un intervallo di dimensioni di 50-150 nm. Hanno origine da corpi multi-vescicolari (MVB) e vengono rilasciati dalle cellule dopo la fusione degli MVB con la membrana plasmatica. Gli sEV contengono miRNA, mRNA, proteine e lipidi bioattivi e queste molecole vengono trasferite tra le cellule sotto forma di comunicazione cellula-cellula. Le sEV possono essere internalizzate dalle cellule riceventi attraverso una varietà di vie endocitiche e questa cattura di sEV da parte delle cellule riceventi è mediata dal riconoscimento delle molecole di superficie sia sugli EV che sul....

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Protocollo

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NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Drexel University College of Medicine. I topi CD-1 gravidi a tempo sono stati utilizzati per la coltura astrocitica e tutte le dighe sono state ricevute 15 giorni dopo l'impregnazione. I topi C57BL/6 di dieci-dodici settimane sono stati utilizzati per esperimenti di assorbimento in vivo.

1. Isolamento di sEV da cellule macrofagiche RAW 264.7

  1. Coltura RAW 264,7 cellule in palloni da 75 cm2 in mezzo impoverito di esoso....

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Risultati

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Dopo l'isolamento dei sEV dai mezzi condizionati RAW 264.7 tramite centrifugazione, nta è stato utilizzato per determinare la concentrazione e la distribuzione dimensionale dei sEV purificati. La dimensione media media delle sEV derivate da RAW 264,7 era di 140 nm e la dimensione delle particelle di picco era di 121,8 nm, confermando che la maggior parte delle particelle rilevabili nella misurazione della diffusione della luce rientrava nell'intervallo di dimensioni degli esosomi o dei sEV a 50-150 nm (

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Discussione

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In questo protocollo, abbiamo mostrato l'etichettatura dei sEV con coloranti PKH e la visualizzazione del loro assorbimento nel midollo spinale. I coloranti fluorescenti lipofili PKH sono ampiamente utilizzati per l'etichettatura delle cellule mediante citometria a flusso e microscopia fluorescente3,5,6,12,24,25. A causa dell.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del NIH NINDS R01NS102836 e del Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) assegnato a Seena K. Ajit. Ringraziamo il Dr. Bradley Nash per la lettura critica del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtri centrifughi Amicon Ultra 0,5 mLMilliporeSigmaZ677094
Anticorpo Anti-AlixAbcamab1864291:1000
Anticorpo Anti-CalnexinaAbcamAb102861:1000
Anticorpo Anti-CD81Santa Cruz Biotechnologysc-1660291:1000
Anticorpo monoclonale Anti-GAPDH (14C10)Segnalazione cellulare Tecnologia21181:1000
Anticorpo anti-proteina acida fibrillare glialeSigma-AldrichMAB3601:500 per IF; 1:1000 per IHC
Anticorpo anti-Iba1Wako019-197411:2000
Anticorpo anti-MAP2ASigma-AldrichMAB3781:500
Albumina sierica bovina (BSA)VWR0332
Filtro cellulare, 40 μ mVWR15-1040-1
Provette per centrifugaThermo Scientific3118-005012.000 x g
Vetrino coprioggetti, 12 mm, #1.5Microscopia elettronica Sciences72230-01
Vetrino coprioggetti, 18 mm, #1.5Microscopia elettronicaSciences 72222-01
DAPISigma-AldrichD9542-1MG1 &; g/mL
DC Protein SaggiBio-Rad500-0116
Deossiribonucleasi I (DNAsi I)MilliporeSigmaD4513-1VL
Asino Anti-coniglio IgG H& L (HRP)Abcamab162841:10000
Asino Anti-Coniglio IgG H& L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-212061:500
Doppio vetrino per microscopio smerigliato, #1Thermo Scientific12-552-5
DPBS senza calcio e magnesioCorning21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-013-CV
Siero fetale bovino impoverito di esosomiGibcoA27208-01
Siero fetale bovino (FBS)Corning35-011-CV
FluorChem M sistema di imagingProteinSimple
FV3000 Microscopio confocaleOlympus
Goat Anti-Mouse IgG H& L (HRP)Abcamab67891:10000
IgG anti-topo di capra H& L, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110011:500
IgG1 anti-topo di capra, Alexa Fluor 594InvitrogenA-211251:500
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)VWR02-0121
HEPESGibco15630080
substrato HRPThermo Scientific34094
Tampone di blocco dell'intercettazione, TBSLI-COR Biosciences927-60001
Laemmli SDS Sample BufferAlfa AesarAAJ61337AC
Micro Cover Glass, #1VWR48404-454
Microm HM550Thermo Scientific
NanoSight NS300 sistemaMalvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 softwareMalvern Panalytical
Linea cellulare Neuro-2aATCCCCL-131
Siero di capra normaleVector LaboratoriesS-1000
OCT CompostoSakura Finetek4583
PapainaWorthington Biochemical CorporationNC9597281
Scienze della microscopia elettronicadella paraformaldeide19210
Penicillina-StreptomicinaGibco15140122
PKH26Sigma-AldrichMINI26-1KT
PKH67Sigma-AldrichMINI67-1KT
Cocktail di inibitori della proteasi ThermoScientific1862209
Membrana di trasferimento PVDFMDISVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Linea cellulareATCCTIB-71
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Cloruro di SodioAMRESCO0241-2.5KG
Superfrost Plus Gold SlidesThermo Scientific15-188-48vetrini adesivi
T-75 FlaconiCorning431464U
Tecnai 12 Microscopio Elettronico a Trasmissione DigitaleFEI Azienda
Geltris-glicinaFSF300-cu FSF300-cu
, 12%InvitrogenXP00120BOX
tampone di corsa SDS Tris-glicinaInvitrogenLC26755
tampone di trasferimento di tris-glicinaInvitrogenLC3675
TrypLE ExpressGibco12605028 enzima
Triton X-100Acros Organics327371000
Tripsina, 0,25%Corning25-053-CL
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Beckman344058110.000 x g
proteico di di dissociazione cellulare Provette per ultracentrifuga

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).
  2. Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in viv....

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Captazione di SEVMarcatura fluorescenteMicroscopia confocaleCellule Neuro 2aAstrociti primariSomministrazione intratecaleWestern blotTrasferimento di carico biomolecolare

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