Questo protocollo descrive l'estrazione di composti organici volatili da un campione biologico con il metodo di estrazione assorbente assistita da vuoto, la gascromatografia accoppiata con la spettrometria di massa utilizzando il binario di preparazione del campione Entech e l'analisi dei dati. Descrive anche la coltura di campioni biologici e il sondaggio isotopico stabile.
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Articolo metodologico
Cattura di composti organici volatili microbici prodotti attivamente da campioni associati all'uomo con estrazione assorbente assistita da vuoto
In questo articolo
Sommario
Abstract
I composti organici volatili (COV) provenienti da campioni biologici hanno origini sconosciute. I COV possono provenire dall'ospite o da organismi diversi all'interno della comunità microbica dell'ospite. Per districare l'origine dei COV microbici, sono state eseguite analisi dello spazio di testa volatile di mono- e co-colture batteriche di Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii e sondaggi isotopici stabili in campioni biologici di feci, saliva, acque reflue ed espettorato. Mono- e co-colture sono state utilizzate per identificare la produzione volatile da singole specie batteriche o in combinazione con il sondaggio isotopico stabile per identificare il metabolismo attivo dei microbi dai campioni biologici.
L'estrazione assorbente assistita da vuoto (VASE) è stata impiegata per estrarre i COV. VASE è un metodo di estrazione dello spazio di testa facile da usare, commercializzato e privo di solventi per composti semi-volatili e volatili. La mancanza di solventi e le condizioni di quasi vuoto utilizzate durante l'estrazione rendono lo sviluppo di un metodo relativamente facile e veloce rispetto ad altre opzioni di estrazione come la terz-butilazione e la microestrazione in fase solida. Il flusso di lavoro qui descritto è stato utilizzato per identificare specifiche firme volatili da mono- e co-culture. Inoltre, l'analisi del sondaggio isotopico stabile di campioni biologici associati all'uomo ha identificato COV che sono stati prodotti comunemente o in modo univoco. Questo documento presenta il flusso di lavoro generale e le considerazioni sperimentali di VASE in combinazione con il sondaggio isotopico stabile di colture microbiche vive.
Introduzione
I composti organici volatili (COV) sono molto promettenti per il rilevamento e l'identificazione batterica perché sono emessi da tutti gli organismi e diversi microbi hanno firme VOC uniche. Le molecole volatili sono state utilizzate come misura non invasiva per rilevare varie infezioni respiratorie tra cui la broncopneumopatia cronica ostruttiva1, la tubercolosi2 nelle urine3 e la polmonite associata al ventilatore4, oltre a distinguere i soggetti con fibrosi cistica (FC) dai soggetti di controllo sani 5,6. Le firm....
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Protocollo
1. Headspace Sorbent Pen (HSP) e considerazioni sull'analisi del campione
NOTA: L'HSP contenente l'assorbente Tenax TA è stato selezionato per catturare un'ampia gamma di sostanze volatili. Tenax ha un'affinità inferiore per l'acqua rispetto ad altri assorbenti, che gli consente di intrappolare più COV da campioni di umidità più elevata. Tenax ha anche un basso livello di impurità e può essere condizionato per il riutilizzo. La selezione del sorbente è stata effettuata anche in considerazione con la colonna installata nel GC-MS (vedi la Tabella dei materiali).
- Generare controlli negativi estraendo supporti e/o cam....
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Risultati
Mono- e co-colture di S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii
Le mono- e co-colture consistevano nelle specie batteriche S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii. Questi sono patogeni opportunistici comuni trovati nelle ferite umane e nelle infezioni croniche. Per identificare le molecole volatili presenti nelle mono- e co-colture, è stata eseguita una breve estrazione di 1 .......
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Discussione
Per identificare la produzione volatile in colture in vitro e campioni associati all'uomo, sono state eseguite analisi volatili di mono- e co-colture di P. aeruginosa, S. aureus e A. baumanii e sondaggi isotopici stabili di diversi campioni biologici. Nell'analisi per le mono- e co-colture, i volatili sono stati rilevati eseguendo una breve estrazione per 1 ora a 70 °C. L'analisi volatile di mono- e co-colture ha permesso l'indagine dei composti prodotti sia dalle singole specie che durante le.......
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Dichiarazioni
V. L. V e S. J.B. D. erano ex dipendenti di Entech Instruments Inc., e K. W. è membro del programma universitario di Entech. J. P., J. K. e C. I. R. non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Heather Maughan e Linda M. Kalikin per l'attenta redazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da NIH NHLBI (sovvenzione 5R01HL136647-04).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 13C glucosio | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL Fiale VOA | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Tappi neri con foro, senza setto | Entech Instruments | 01-39-76044B | mantiene il rivestimento del coperchio in posizione sulla fiala |
| Rivestimento della fiala da 24 mm per penne assorbenti | Entech Instruments | SP-L024S | consente alle penne di effettuare una sigillatura sottovuoto sulla parte superiore della fiala |
| 5600 Unità di estrazione della penna assorbente (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Unità di estrazione della penna assorbente -120 VAC |
| Piastre per saggi a 96 pozzetti | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Colonna Agilent | ||
| DB-624 | Agilent | 122-1364E | 60 m, diametro interno 0,25 mm, spessore film 1,40 micron, in GC-MS |
| Ossido di deuterio | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC e 5975C MSD XL inerte con rivelatore a tre assi) | Agilent | 7890A GC e 5975C MSD XL inerte con triplo asse rivelatore | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Articoli per l'estrazione dello spazio di testa inclusi nel bundle |
| Penna assorbente per lo spazio di testa (HSP) - vuoto | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Penna assorbente per lo spazio di testa (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Provette per microcentrifuga (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-ring | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Guida per la preparazione dei campioni Entech | Instruments | ||
| Condizionatore termico a penna assorbente | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
Riferimenti
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al.
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Ristampe e permessi
