Nel presente protocollo, dimostriamo come visualizzare la resezione finale a doppio filamento del DNA durante la fase S/ G2 del ciclo cellulare utilizzando un metodo basato sull'immunofluorescenza.
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Articolo metodologico
Valutazione della resezione finale globale a doppio filamento del DNA utilizzando l'etichettatura BrdU-DNA abbinata all'imaging di discriminazione del ciclo cellulare
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio della risposta al danno al DNA (DDR) è un campo complesso ed essenziale, che è diventato più importante solo a causa dell'uso di farmaci mirati alla DDR per il trattamento del cancro. Questi bersagli sono poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP), che avviano varie forme di riparazione del DNA. L'inibizione di questi enzimi utilizzando inibitori PARP (PARPi) raggiunge una letalità sintetica conferendo una vulnerabilità terapeutica nelle cellule carenti di ricombinazione omologa (HR) a causa di mutazioni nel cancro al seno di tipo 1 (BRCA1), BRCA2 o partner e localizzatore di BRCA2 (PALB2).
Le cellule trattate con PARPi accumulano rotture a doppio filamento di DNA (DSB). Queste rotture vengono elaborate dal meccanismo di resezione finale del DNA, portando alla formazione di DNA a singolo filamento (ss) e alla successiva riparazione del DNA. In un contesto carente di BRCA1, la resezione rinvigorente del DNA attraverso mutazioni in inibitori della resezione del DNA, come 53BP1 e DYNLL1, causa resistenza al PARPi. Pertanto, essere in grado di monitorare la resezione del DNA nel cellulo è fondamentale per una comprensione più chiara dei percorsi di riparazione del DNA e lo sviluppo di nuove strategie per superare la resistenza al PARPi. Le tecniche basate sull'immunofluorescenza (IF) consentono il monitoraggio della resezione globale del DNA dopo il danno al DNA. Questa strategia richiede l'etichettatura del DNA genomico a impulsi lunghi con 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU). Dopo il danno al DNA e la resezione finale del DNA, il DNA a singolo filamento risultante viene specificamente rilevato da un anticorpo anti-BrdU in condizioni native. Inoltre, la resezione del DNA può anche essere studiata utilizzando marcatori del ciclo cellulare per differenziare tra le varie fasi del ciclo cellulare. Le cellule nella fase S/G2 consentono lo studio della resezione finale all'interno di HR, mentre le cellule G1 possono essere utilizzate per studiare l'unione finale non omologa (NHEJ). Un protocollo dettagliato per questo metodo IF accoppiato alla discriminazione del ciclo cellulare è descritto in questo documento.
Introduzione
La modulazione dei fattori di riparazione del DNA è un metodo in continua evoluzione per la terapia del cancro, in particolare negli ambienti tumorali carenti di riparazione del DNA DSB. L'inibizione di specifici fattori di riparazione è una delle strategie ingegnose utilizzate per sensibilizzare le cellule tumorali agli agenti dannosi per il DNA. Decenni di ricerca hanno portato all'identificazione di varie mutazioni dei geni di riparazione del DNA come biomarcatori per le scelte di strategia terapeutica1. Di conseguenza, il campo della riparazione del DNA è diventato un hub per lo sviluppo di farmaci per garantire una vasta gamma di trattamen....
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Protocollo
1. Coltura cellulare, trattamenti e preparazione del coverslip
NOTA: Tutte le placcature cellulari, le trasfezioni e i trattamenti, a parte l'irradiazione, dovrebbero avvenire sotto una cappa sterile di coltura cellulare.
- Giorno 1
- In una piastra a 6 pozzetti, posizionare un singolo coperchio in ciascun pozzetto per tutte le condizioni necessarie. Piastra ~ 150.000 cellule HeLa per la trasfezione o il trattamento farmacologico, come desiderato.
NOTA: In caso di trasfezione, si consiglia di eseguire una trasfezione inversa al momento della placcatura, oppure è possibile eseguire una trasfezione in avanti diverse ore dopo ....
- In una piastra a 6 pozzetti, posizionare un singolo coperchio in ciascun pozzetto per tutte le condizioni necessarie. Piastra ~ 150.000 cellule HeLa per la trasfezione o il trattamento farmacologico, come desiderato.
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Risultati
In questo protocollo, il saggio basato sulla bromodeossiuridina (BrdU) è stato utilizzato per misurare quantitativamente la risposta di resezione delle cellule HeLa al danno indotto dall'irradiazione. Le tracce di ssDNA generate vengono visualizzate come focolai distinti dopo la colorazione di immunofluorescenza (Figura 1A). I focolai identificati sono stati quindi quantificati ed espressi come l'intensità totale integrata della colorazione BrdU nei nuclei (Figura 1B
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Discussione
Questo documento descrive un metodo che utilizza la colorazione IF per misurare le variazioni nella resezione del DNA nel cellulo. Lo standard attuale per osservare un effetto sulla resezione del DNA è attraverso la colorazione RPA; tuttavia, questo è un metodo indiretto che può essere influenzato dalla replicazione del DNA. In precedenza, è stata descritta un'altra tecnica IF di resezione del DNA basata sull'incorporazione di BrdU per classificare le intensità risultanti nelle cellule BrdU-positive e BrdU-negat.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Marie-Christine Caron per l'eccellente consulenza tecnica. Questo lavoro è supportato da finanziamenti del Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. detiene una cattedra di ricerca canadese di livello 1 in riparazione del DNA e terapie del cancro. J.O'S è uno studente di dottorato FRQS e S.Y.M è un borsista post-dottorato FRQS.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alexa 568 capra anti-coniglio | Sonde molecolari | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 capra anti-topo | Sonde molecolari | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Fatto in casa | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-alfa tubulina (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Irradiatore di raggi X da banco | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeossiuridina (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Profilatore cellulare | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Pellicola da imballaggio da laboratorio 4 pollici / 250 piedi | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM ad alto glucosio | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetale Siero bovino | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Occhiali di copertura: Quadrati 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Microscopio fluorescente | Leica | DMI6000B | 63x Obiettivo a immersione |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATORE CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Ago | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Saccarosio | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher pinzette | ||
Riferimenti
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-path....
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Ristampe e permessi
