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Articolo metodologico

In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

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⸱

DOI:

10.3791/62554

⸱

11 maggio 2021

 ,  ,  , 
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology), Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris, INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

In questo articolo

Sommario

Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l'angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.

Abstract

I recenti progressi nelle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e nelle tecnologie di modifica genetica consentono lo sviluppo di nuovi modelli di malattia basati su cellule umane per programmi di scoperta di farmaci fenotipici (PDD). Sebbene questi nuovi dispositivi possano prevedere la sicurezza e l'efficacia dei farmaci sperimentali negli esseri umani in modo più accurato, il loro sviluppo in clinica dipende ancora fortemente dai dati dei mammiferi, in particolare l'uso di modelli di malattia murina. Parallelamente ai modelli di malattia organoide umana o organo-on-chip, lo sviluppo di pertinenti modelli murini in vitro è quindi un'esigenza insoddisfatta per valutare l'efficacia diretta dei farmaci e i confronti di sicurezza tra specie e condizioni in vivo e in vitro . Qui viene descritto un saggio di germinazione vascolare che utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi (EB). Gli EB vascolarizzati coltivati su gel di collagene 3D sviluppano nuovi vasi sanguigni che si espandono, un processo chiamato angiogenesi che germoglia. Questo modello riassume le caratteristiche chiave dell'angiogenesi in vivo che germoglia la formazione dei vasi sanguigni da una rete vascolare preesistente, compresa la selezione delle cellule della punta endoteliale, la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali, la guida cellulare, la formazione del tubo e il reclutamento delle cellule murali. È suscettibile di screening per farmaci e geni che modulano l'angiogenesi e mostra somiglianze con saggi vascolari tridimensionali (3D) recentemente descritti basati su tecnologie iPSC umane.

Introduzione

Negli ultimi tre decenni, la scoperta di farmaci basata sul bersaglio (TDD) è stata ampiamente utilizzata nella scoperta di farmaci dall'industria farmaceutica. TDD incorpora un bersaglio molecolare definito che svolge un ruolo importante in una malattia e si basa sullo sviluppo di sistemi di coltura cellulare relativamente semplici e letture per lo screening dei farmaci1. La maggior parte dei modelli di malattia tipici utilizzati nei programmi TDD includono metodi tradizionali di coltura cellulare come cellule tumorali o linee cellulari immortalizzate coltivate all'interno di ambienti artificiali e substrati non fisiologici. Sebbene molti di questi modelli abbiano fornito strumenti validi per identificare farmaci candidati di successo, l'uso di tali sistemi può essere discutibile a causa della loro scarsa rilevanza per la malattia2.

Per la maggior parte delle malattie, i meccanismi sottostanti sono infatti complessi e vari tipi di cellule, vie di segnalazione indipendenti e più set di geni sono spesso trovati per contribuire a uno specifico fenotipo di malattia. Questo vale anche per le malattie ereditarie in cui la causa primaria è una mutazione in un singolo gene. Con il recente avvento delle tecnologie delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e degli strumenti di modifica genetica, è ora possibile generare organoidi 3D e modelli di malattia organ-on-chip che potrebbero ricapitolare meglio la complessità umana in vivo 3,4. Lo sviluppo di tali tecnologie è associato a una rinascita dell'interesse per i programmi di scoperta di farmaci fenotipici (PDD)1. La PDD può essere paragonata allo screening empirico, in quanto non si basano sulla conoscenza dell'identità di uno specifico bersaglio farmacologico o su un'ipotesi sul suo ruolo nella malattia. L'approccio PDD è ora sempre più riconosciuto per contribuire fortemente alla scoperta di farmaci di prima classe5. Poiché lo sviluppo delle tecnologie organoidi umane e organ-on-chip è ancora agli inizi, si prevede che i modelli iPSC (integrati con strumenti innovativi di imaging e apprendimento automatico6,7) forniranno, nel prossimo futuro, molteplici nuovi modelli di malattia basati su cellule complesse per lo screening dei farmaci e i programmi PDD associati per superare la scarsa produttività dell'approccio TDD8, 9.

Mentre i modelli organoidi umani e organ-on-chip possono fornire importanti informazioni sulla complessità della malattia e sull'identificazione di nuovi farmaci, portare i farmaci nella nuova pratica clinica si basa fortemente anche sui dati provenienti da modelli animali per valutarne l'efficacia e la sicurezza. Tra questi, i topi geneticamente modificati sono sicuramente i modelli di mammiferi più preferiti. Hanno molti vantaggi in quanto hanno un tempo di generazione relativamente breve per i mammiferi, hanno molti fenotipi simili alle malattie umane e possono essere facilmente manipolati geneticamente. Sono quindi ampiamente utilizzati nei programmi di scoperta di farmaci10. Tuttavia, colmare il divario tra topi e umani rimane una sfida importante11. Lo sviluppo di modelli murini in vitro equivalenti agli organoidi umani e ai modelli organo-on-chip potrebbe colmare almeno parzialmente questa lacuna, in quanto consentirà confronti diretti dell'efficacia e della sicurezza dei farmaci tra i dati in vivo sul topo e quelli umani in vitro .

Qui viene descritto un test di germinazione vascolare nei corpi embrioidi di topo (EB). I vasi sanguigni sono composti da cellule endoteliali (rivestimento interno delle pareti dei vasi), cellule murali (cellule muscolari lisce vascolari e periciti)12. Questo protocollo si basa sulla differenziazione di cellule staminali embrionali di topo (mESC) in EB vascolarizzati utilizzando goccioline sospese che ricapitolano de novo la cellula endoteliale e la differenziazione delle cellule murali13,14. Le ESC di topo possono essere facilmente stabilite in coltura da blastocisti isolate di topo al giorno 3.5 con background genetico diverso15. Forniscono anche possibilità per l'analisi clonale, il tracciamento del lignaggio e possono essere facilmente manipolati geneticamente per generare modelli di malattia13,16.

Poiché i vasi sanguigni nutrono tutti gli organi, non sorprende che molte malattie, se non tutte, siano associate a cambiamenti nella microvascolarizzazione. In condizioni patologiche, le cellule endoteliali possono adottare uno stato attivato o possono diventare disfunzionali con conseguente morte delle cellule murali o migrazione lontano dai vasi sanguigni. Questi possono provocare un'eccessiva angiogenesi o rarefazione dei vasi, possono indurre un flusso sanguigno anormale e una barriera dei vasi sanguigni difettosa che porta a stravaso delle cellule immunitarie e infiammazione12,17,18,19. La ricerca per lo sviluppo di farmaci che modulano i vasi sanguigni è, quindi, elevata, e sono già stati identificati molteplici attori e concetti molecolari per il targeting terapeutico. In questo contesto, il protocollo descritto è particolarmente adatto per la costruzione di modelli di malattia e per test farmacologici in quanto riassume le caratteristiche chiave dell'angiogenesi in vivo che germoglia, tra cui la selezione delle cellule endoteliali della punta e del peduncolo, la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali, la guida delle cellule endoteliali, la formazione del tubo e il reclutamento delle cellule murali. Mostra anche somiglianze con saggi vascolari 3D recentemente descritti basati su tecnologie iPSC umane20.

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Protocollo

1. Preparazione dei media e cultura del mESC

  1. Preparare il terreno condizionato +/- (CM+/-) utilizzando il supplemento 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) terreno con il 10% (vol/vol) di siero fetale bovino (FBS) inattivato dal calore, 0,05 mM β-mercaptoetanolo, 1x aminoacidi non essenziali (NEAA 1x), 2 mM L-glutammina e 1 mM di piruvato di sodio.
  2. Preparare il mezzo condizionato +/+ (CM+/+) utilizzando il mezzo CM+/- con fattore inibitorio della leucemia (LIF) (1.500 U/mL) e 0,1 mM β-mercaptoetanolo.
  3. Preparare il terreno condizionato +/+ in presenza di due inibitori (CM+/+ 2i) utilizzando il mezzo CM+/+ con 1 μM PD0325901 e 3 μM CHIR99021.
  4. Preparare una soluzione di gelatina allo 0,1% mescolando 25 ml di soluzione di gelatina al 2% preriscaldata in 500 ml di soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio (DPBS).
  5. Preparare 10x tampone Trypsin Versene Phosphate (TVP 10x) mescolando Tripsina (2,5%) con TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% siero di pollo, 0,01% Tripsina (2,5%) in H2O) (rapporto 1:10, vol/vol).
    NOTA: filtrare tutte le soluzioni attraverso un filtro per pori da 0,22 μm. Conservare il terreno di coltura a -20 °C per lungo tempo e conservare gli altri reagenti a 4 °C per un massimo di 3 settimane (vedere Tabella dei materiali).
  6. Rivestire due piastre di coltura cellulare a 12 pozzetti con soluzione di gelatina allo 0,1% (500 μL per pozzetto) e incubarle per 30 minuti in un incubatore di CO 2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida).
  7. Lavare le piastre ricoperte di gelatina con PBS e aggiungere 500 μL di mezzo CM+/-.
  8. Scongelare due flaconcini di 1 x 106 fibroblasti embrionali di topo (MEF) irradiati crioconservati a 37 °C e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico con 5 mL di mezzo CM+/-.
  9. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Aspirare il terreno e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 12 ml di CM+/- terreno ad una concentrazione di 1,67 x 105 cellule per ml.
  10. Seminare 500 μL di sospensione di MEF in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti (2,4 x 105 cellule per cm 2) e incubare la piastra per una notte (o/n) in un incubatore di CO2.
  11. Scongelare un flaconcino di mESC crioconservate (1 x 106) in mezzo CM+/+ 2i.
  12. Seminare la sospensione di mESC su una piastra prelavata a 12 pozzetti con MEF in 1 mL di mezzo CM+/+ 2i e trasferire la piastra in un incubatore di CO2 . Aggiorna il mezzo ogni giorno.
  13. Al 70% di confluenza, lavare le colonie di mESC con DPBS. Aggiungere 150 μL di tampone TVP caldo 10x e incubare a RT per 30 s per avviare la dissociazione enzimatica.
  14. Rimuovere con cautela il tampone TVP, risospendere le cellule in 1 mL di mezzo CM+/+ 2i e dissociare le colonie in singole cellule mediante pipettaggio delicato.
  15. Far passare le cellule trasferendole in una nuova piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti con MEF (rapporto di scissione: 1:3-1:5). Mescolare delicatamente per distribuire le cellule e incubare in un incubatore di CO2 .
  16. Rinfrescare il terreno di coltura (2-3 ml) e osservare quotidianamente la crescita/morfologia cellulare. Ripetere il passaggio seriale al 70% di confluenza ogni 2 giorni. Passare al mezzo CM+/+ per due passaggi prima di iniziare la differenziazione cellulare.

2. Formazione di EB in goccia sospesa

  1. Preparare un nuovo mezzo di differenziazione del mesoderma integrando il terreno CM+/- con il fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) (50 ng·mL-1) e con la proteina morfogenetica ossea 4 (BMP-4) (5 ng·mL-1) e mantenerlo a 4 °C fino all'uso.
  2. Rivestire un pozzetto della piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con 500 μL di soluzione di gelatina allo 0,1% e metterlo in un incubatore di CO2 per 30 minuti.
  3. Lavare le piastre ricoperte di gelatina con PBS e aggiungere 500 μL di mezzo CM+/-.
  4. Per ottenere una popolazione pura di mESC, tripsinizzare la piastra di coltura cellulare con tampone TVP 10x per 30 s a RT, risospendere le cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione del mesoderma e quindi trasferirle sulla piastra a 6 pozzetti rivestita di gelatina per 30 minuti consentendo ai MEF di attaccarsi mentre i mESC rimangono in sospensione.
  5. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 ml e contare le cellule utilizzando un emocitometro Neubauer e un colorante blu Trypan per un'esclusione di cellule vive / morte.
  6. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare nel mezzo di differenziazione del mesoderma per raggiungere 4,55 x 104 cellule per ml.
  7. Riempire il fondo di piatti di polistirene a basso attacco da 94 mm con 15 ml di acqua sterile.
    NOTA: Quattro piatti contenenti gocce appese (1,6 x 105 cellule in 3,52 ml di terreno) saranno necessari per testare una particolare condizione utilizzando il saggio di angiogenesi 3D sprouting.
  8. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio di plastica sterile e caricare quattro posizioni di una pipetta multicanale con 22 μL di sospensione cellulare per canale (1 x 103 celle per 22 μL di goccia).
  9. Sollevare e capovolgere il coperchio del piatto da 94 mm e posizionarlo sulla superficie pulita dell'armadio di flusso con il lato interno rivolto verso l'alto.
  10. Depositare 40 gocce della sospensione cellulare sulla superficie interna di ciascun coperchio. Capovolgere con attenzione il coperchio senza disturbi e riposizionarlo sul piatto, in modo che le gocce siano rivolte verso l'acqua.
  11. Incubare i piatti in un incubatore di CO2 . Considera questo come differenziazione giorno 0. Mantenere le piastre per 4 giorni per formare EB.

3. Saggio di competizione per la posizione della cellula della punta

  1. Coltura una linea mESC fluorescente e una non fluorescente come descritto in precedenza13. Ad esempio, vengono utilizzati mESC 7ACS/EYFP etichettati in giallo e mESC R1.
  2. Preparare gli EB a mosaico mescolando quantità uguali delle due linee mESC (rapporto 1:1) e incubare i piatti a goccia sospesi in un incubatore di CO 2 come descritto nella fase2 .

4. Coltura galleggiante di EBs per il differenziamento vascolare

  1. Prima di raccogliere gli EB dalle gocce sospese, preparare quanto segue.
    1. Preparare la soluzione di agar al 5% in H2O e sterilizzarla mediante autoclave (20 min a 120 °C).
    2. Utilizzare la soluzione calda di agar al 5% per preparare G-MEM BHK-21 terreno contenente l'1% di agar e versare rapidamente 3 ml in uno dei piatti di polistirene da 60 mm. Lasciare solidificare l'agar per 1 ora a RT. Conservare le stoviglie a 4 °C fino all'uso.
  2. Preparare un mezzo di differenziazione vascolare fresco 2x completando il mezzo CM+/- con bFGF (100 ng·mL-1) e VEGF-A (50 ng·mL-1). Conservare il fluido a 4 °C fino all'uso.
  3. Raccogliere le gocce sospese in un tubo conico da 15 mL utilizzando una pipetta P1000 e rimuovere il surnatante dopo alcuni minuti di sedimentazione EB.
  4. Risospendere gli EB in 3 mL di mezzo di differenziazione vascolare 2x, trasferire la sospensione EB in un piatto rivestito di agar e distribuire gli EB in modo omogeneo per evitare l'aggregazione.
  5. Incubare i piatti nell'incubatore CO 2 e rinfrescare il terreno ogni2 giorni fino al giorno 9 utilizzando 1x mezzo di differenziazione vascolare in presenza di bFGF (50 ng·mL-1) e VEGF-A (25 ng·mL-1).
  6. In alternativa, aggiungere il fattore di crescita derivato dalle piastrine-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 il giorno 4 e 5 ng·mL-1 il giorno 6 e il giorno 8) al mezzo di differenziazione vascolare per promuovere la differenziazione delle cellule murali.

5. Analisi della citometria a flusso

  1. Raccogliere gli EB di 9 giorni in un tubo conico da 15 mL utilizzando una pipetta P1000 e lavarli una volta con PBS caldo.
  2. Aggiungere 1 ml di terreno G-MEM BHK-21 contenente 0,2 mg·mL-1 di collagenasi A e incubare le cellule in un incubatore di CO2 per 5 minuti.
  3. Dissociare gli EB mediante pipettaggio delicato su e giù con una pipetta P1000.
  4. Interrompere l'attività della collagenasi aggiungendo 1 mL di terreno freddo G-MEM BHK-21 con FBS al 10%.
  5. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT.
  6. Risospendere le cellule in 500 μL di PBS con FBS al 2%.
  7. Contare le cellule utilizzando un emocitometro Neubauer.
  8. Risospendere 400.000 cellule in 100 μL di PBS con FBS al 2% per condizione di colorazione.
  9. Incubare le cellule per 45 minuti a 4 °C con i seguenti anticorpi: APC coniugato ratto anti-topo PECAM-1 anticorpo (clone MEC13.3) e FITC coniugato ratto anti-topo CD45 (clone 30-F11) o anticorpi isotype control.
  10. Lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS contenente il 2% di FBS.
  11. Risospendere le cellule per raggiungere una concentrazione finale di 5 x 106 cellule per ml.
  12. Filtrare le celle utilizzando una provetta in polistirene a fondo rotondo, con un tappo a scatto per filtri cellulare.
  13. Analizzare 20.000 eventi PECAM-1 (+) mediante citometria a flusso.

6.3D Saggio di angiogenesi germinativa e colorazione con immunofluorescenza

  1. Al giorno 9, preparare un terreno di germinazione aggiungendo il 10% di FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), eritropoietina ricombinante umana (hEPO) (20 ng·mL-1), interleuchina-6 umana (IL-6) (10 ng·mL-1), 0,05 mM β-mercaptoetanolo, NEAA (1x), L-glutammina (1x), piruvato di sodio (1x), collagene della coda di ratto di tipo I (1,25 mg·mL-1), e NaOH (3,1 mM) al mezzo GMEM BHK-1.
  2. Per evitare la gelificazione del collagene, mantenere il mezzo di germinazione sul ghiaccio fino all'uso.
  3. Per valutare l'effetto delle molecole pro/anti-angiogeniche, aggiungere il farmaco o il veicolo selezionato al mezzo di germinazione alla concentrazione selezionata.
  4. Raccogliere EB di 9 giorni da una capsula di agar da 60 mm in un tubo conico da 15 ml (equivalente a una condizione) e rimuovere il surnatante dopo alcuni minuti di sedimentazione.
  5. Coprire il fondo di una capsula di coltura da 35 mm con 1 mL del terreno di germinazione e incubare a 37 °C per 5 minuti per indurre la gelificazione.
  6. Risospendere gli EB in 2 ml di terreno di germinazione a freddo.
  7. Trasferire la sospensione sul piatto di coltura da 35 mm rivestito con il primo strato di terreno di germinazione.
  8. Distribuire gli EB su tutta la piastra e assicurarsi che siano a una distanza uguale l'uno dall'altro. Incubare il piatto in un incubatore di CO2 . La prima formazione di germogli avviene entro 24-48 h.
  9. Al giorno 12, il gel di collagene contenente EB viene accuratamente trasferito su un vetrino (75 x 26 mm) utilizzando una spatola.
  10. Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta (P1000) e disidratare il gel posizionando un foglio di garza di lino di nylon e schede filtranti assorbenti (carta assorbente) sopra il gel. Applicare pressione posizionando un peso (250 g) per 2 min. Rimuovere con attenzione la carta da filtro in nylon e lasciare asciugare i vetrini all'aria per 30 minuti a RT.
  11. Lavare i vetrini tre volte con PBS per 5 minuti su RT.
  12. Fissare gli EB utilizzando una soluzione di zinco (vedi tabella dei materiali) o/n a 4 °C. In alternativa, fissare gli EB fluorescenti a mosaico con Paraformaldeide (PFA) (4%) o/n a 4 °C al buio.
  13. Rimuovere il fissativo. Lavare i vetrini cinque volte con PBS per 5 minuti su RT.
  14. Permeabilizzare gli EB in PBS contenenti lo 0,1% di Triton-X100 per 15 minuti a RT.
  15. Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione. Lavare i vetrini cinque volte con PBS per 5 minuti.
  16. Incubare gli EB nel tampone bloccante (PBS con 2% di albumina sierica bovina, BSA) per 1 ora a RT.
  17. Per colorare i germogli endoteliali, utilizzare un anticorpo primario anti-topo anti-PECAM-1 (diluizione 1:100) nel tampone o/n bloccante a 4 °C.
  18. Lavare i vetrini cinque volte con PBS per 5 minuti.
  19. Incubare i vetrini con l'anticorpo secondario Alexa 555 anti-ratto di capra nel tampone bloccante (diluizione 1:250) e, quando necessario, con l'anticorpo anti-α-SMA coniugato con FITC nel tampone bloccante (diluizione 1:250) per colorare le cellule murali per 2 ore a RT al buio.
  20. Lavare le guide tre volte con PBS per 5 minuti e una volta con H20 prima di montarle.

7. Imaging confocale, analisi morfometrica e quantitativa di germogli endoteliali EB

  1. Acquisire immagini ad alta risoluzione degli EB immunocolorati mediante fusione del piano focale (z-stacking) utilizzando un microscopio confocale. Usa l'obiettivo di ingrandimento 10x per visualizzare interi EB.
  2. Analizzare le immagini acquisite utilizzando ImageJ per valutare la morfologia e quantificare le caratteristiche dei germogli endoteliali PECAM-1 positivi secondo i metodi di quantificazione stabiliti13,14,21.
    1. Calcola il numero medio di germogli endoteliali per EB contando manualmente il numero totale di germogli per singoli EB.
    2. Misurare le singole lunghezze dei germogli utilizzando lo strumento di disegno ImageJ. Definire la base del germoglio endoteliale a partire dall'area centrale EB e tracciare manualmente una linea fino all'estremità della punta del germoglio.
    3. Calcolare il numero medio di cellule di punta per germoglio contando manualmente il numero di celle di punta per singolo germoglio e quindi calcolare la media per EB.
    4. Calcolare l'orientamento della filopodia determinando manualmente l'asse del germoglio genitore e misurare l'angolo acuto tra di essi utilizzando lo strumento angolare del software ImageJ. Calcola il numero di germogli con un orientamento >50° e dividilo per il numero totale di germogli dell'EB di interesse.
      NOTA: Gli angoli variavano sempre da 0° a 90°.
  3. Acquisire immagini ad alta risoluzione degli EB immunocolorati utilizzando un microscopio confocale. Utilizza l'obiettivo di ingrandimento 40x per realizzare immagini ad alta risoluzione di singoli germogli endoteliali.
  4. Quantificare la copertura dei vasi dei germogli EC positivi a PECAM-1 circondati da MC positivi α-SMA utilizzando il software ImageJ.
    1. Dividi le immagini unite in canali rossi e verdi separati.
    2. Converti le immagini nella sua forma binaria.
    3. Misurare l'area cellulare totale del germoglio occupata separatamente da PECAM-1 (cellule endoteliali marcate in rosso) e da cellule positive α-SMA (cellule murali etichettate in verde).
    4. Generare l'immagine unita utilizzando la funzione calcolatrice di immagini e l'operatore AND. Misurare l'area cellulare totale dell'immagine. Per calcolare la copertura, dividere l'area dell'immagine colocalizzata per l'area dell'immagine binaria PECAM-1.
  5. Per analizzare la competizione cellulare per la posizione delle cellule endoteliali di punta / stelo dei germogli sviluppati dagli EB a mosaico, valutare manualmente il numero di cellule di punta e contrassegnare la loro origine genotipica in base al segnale di fluorescenza. Calcola i valori medi per EB.

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Risultati

La panoramica del protocollo del test di germinazione dei vasi sanguigni è mostrata nella Figura 1. Gli EB di nove giorni derivati da tre linee mESC indipendenti 129/Ola (Z/Red, R1 ed E14) sono stati dissociati enzimaticamente in singole cellule usando la collagenasi A. Le cellule sono state colorate per PECAM-1 e analizzate mediante Fluorescence-activated cell sorting (FACS) come descritto. Tutte le linee cellulari hanno mostrato una robusta differenziazione endoteliale e non sono state oss...

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Discussione

Questo protocollo descrive un test imparziale, robusto e riproducibile basato sulla germinazione vascolare 3D basato su EB che è suscettibile di screening per farmaci e geni che modulano l'angiogenesi. Questo metodo offre vantaggi rispetto a molti saggi bidimensionali (2D) ampiamente utilizzati che utilizzano colture di cellule endoteliali come le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) per monitorare la migrazione (test di graffio laterale o il saggio della camera di Boyden)22,23 o proliferazione (conteg...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, e dall'Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-mercaptoetanoloMiliporo, Merck805740Rischio biologico: è necessario adottare adeguate istruzioni di sicurezza quando si maneggia
Agar NobleDifco, BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 capra anti ratto IgGLife technologiesA21434
APC coniugato ratto anti-topo anticorpo PECAM-1 (clone MEC13.3)BD Biosciences551262
APC Ratto IgG2a κ Controllo isotipo (clone  R35-95)BD Biosciences553932
Axiovert 25 Microscopio per colture tissutali a contrasto di fase invertitoZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)Peprotech450-33
, Allegra X-15RBeckman Coulter392932
Cabina di biosicurezza BioVanguard (Green Line)Telstar133H401001
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA9418
Camera di conteggio cellulare, Buerker, 0,100 mmMarienfeld640211
Piastre per colture cellulari 60 x 15 mmCorning353802
Piastre per colture cellulari, 35 x 10 mmCorning353801
Piastre per colture cellulari a 12 pozzettiCorning3512
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBiorad1855196
Siero di polloSigma-AldrichC5405
CHIR-99021 (CT99021) HClSelleckchemS2924
Collagene I, alta concentrazione, coda di ratto, 100 mgCorning354249
Collagenasi ARoche10103586001
scansione laser confocale Microscopio, TCS SP5Leica
Occhiali di copertura, 24 & 50 mmVwr631-0146
DAPT γ? inibitore della secretasiSigma AldrichD5942
DC101 anti topo VEGFR-2 CloneBioXcellBP0060
DC101 isotipo ratto IgG1BioXcellBP0290
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma-AldrichD2438-5XBiohazard: è necessario adottare adeguate istruzioni di sicurezza quando si maneggia
DPBS (10x), senza calcio, senza magnesioGibco, Thermofisher scientific14200067
EDTA 40 mMGibco, Thermofisher scientific15575-038
Siero fetale bovino con cellule staminali embrionaliGibco, Thermofisher scientific16141-079Dovrebbe essere testato per la massima vitalità e crescita delle cellule ES. Il calore si inattiva a 60 gradi C e conservare a &meno; 20 ° C per un massimo di 1 anno
Eppendorf Microcentrifuge 5415REppendorf AG
Eritropoietina, umana (hEPO), 250 U (2,5 & micro; g) (1 mL)Proteina
Roche (10? unità    1 mL)Milipore, MerckESG1107
Provette Falcon 15 mLGreiner Bio-One188271
Provette Falcon 50 mLGreiner Bio-0ne227270
Puntale filtrante ,trasparente ,sterile F.Gilson, P-200Greiner Bio-One739288
Puntale filtrante ,trasparente ,sterile F.Gilson, P10Greiner Bio-One771288
Puntale filtrante ,trasparente , sterile F.Gilson, P1000Greiner Bio-One740288
FITC coniugato anti-alfa; Actina muscolare liscia (SMA) (clone 1A4)Sigma AldrichF3777
FITC coniugato ratto anti-topo CD45 (clone 30-F11)Biolegend103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticorpo (clone RTK4530)Biolegend400605
Mezzi di montaggio fluorescentiDAKOS3023
GascompressCutisoft45846
Garza Cutisoft 10 x 10 cmBsn Medical45844_00
Carta assorbente in gel, grado GB003WhatmanWHA10547922
Soluzione di gelatina, tipo BSigma-AldrichG1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM)Gibco, Thermofisher scientific21710082
IHC Zinc FixativeBD Pharmigen550523
IncuSafe CO2 IncubatorPHCBiMCO-170AICUV-PE
Interleuchina-6, umano (hIL-6)Roche11138600001
L-Glutammina 200 mMGibco, Thermofisher scientific25030-024
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)Gibco, Thermofisher scientific11140035
Scatola di vetrini per microscopioKartell Labware278
Vetrino per microscopio, StarfrostKnittel in vetroVS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagen
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00114576
Fibroblasti embrionali inattivati di topo (ICR)  (2 metri)Gibco, Thermofisher scientificA24903Conservare le fiale in azoto liquido (195,79 ° C) linea
di cellule staminali embrionali di topo a tempo indeterminato 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)ATCCSCRC-1033generata dal dottor A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Meccanismi di sviluppo. 76 (1– 2), 79– 90 (1998)].
Linee di cellule staminali embrionali di topo Acvrl1 +/- e Acvrl1 +/+Generate presso il Leiden University Medical Center [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698– 2712 (2018)].
Cellule staminali embrionali di topo linea E14Fornito dal laboratorio M Letarte e generato secondo Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635– 3642 (2001).
Cellule staminali embrionali di topo linea R1 (ATCC SCRC-1011)ATCCSCRC-1011Generato dal dottor A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedimenti dell'Accademia Nazionale delle Scienze degli Stati Uniti d'America. 90 (18), 8424– 8428 (1993)].
Cellule staminali embrionali di topo linea Z/Red (ceppo 129/Ola)Generato dal Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241– 246 (2004)].
Spettrofotometro UV/VIS NanoDrop 1000Thermo Fischer ScientificND-1000
PD0325901SelleckchemS1036
PDGF-BB,Peprotech100-14B
Pecam-1 umano ricombinante, Rat Anti-MouseBD Biosciences550274
Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL)Gibco, Thermofisher scientific
piastra di Petri, PS, 94/16 mm, standard, con prese d'aria, sterileGreiner Bio-One633181
Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155 019
Pipetman G Multicanale P8 x 200GGilsonF144072
Pipetman G Starter Kit, kit di 4 pipette, P2G, P20G, P200G, P1000GGilsonF167360
BMP-4 umano ricombinante R& Proteine D Systems314-BP
RNeasy Plus mini KitQIAGEN74134
Pipette sierologiche, 10 mLGreiner Bio-One607 180
Pipette sierologiche, 25 mLGreiner Bio-One760 180
Pipette sierologiche, 5 mLGreiner Bio-One606 180
Idrossido di sodio (NaOH)Merck106498
Piruvato di sodio 100 mMGibco, Thermofisher scientific11360039
Provette 5ml a fondo tondo con tappo del filtro cellulareCorning352235
Termociclatore, T100Biorad1861096
Triton X-100 (BioXtra)Sigma AldrichT9284
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco, Thermofisher scientific
Tripsina (2,5%)Gibco, Thermofisher scientific15090046
Sistema di Filtraggio/Flacone di Stoccaggio, 500 mLCorning430758
VEGFA165 ,Peprotech450-32
, Bagnomaria sterileFresenius-KabiB230531
Lab-Line DigitalThermo Fischer Scientific18052A
Centrifuga da banco Z605212 LIF di topo ricombinante 11120166001 QT00099064 Anticorpo 1514012215250061 Acqua murina ricombinante,

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