Diversi modelli di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo) sono utilizzati nella ricerca sperimentale sull'ictus. Qui, viene descritto un modello sperimentale di ictus di MCAo transitorio attraverso l'arteria carotide esterna (ECA), che mira a imitare l'ictus umano, in cui il trombo cerebrovascolare viene rimosso a causa della lisi spontanea del coagulo o della terapia.
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Articolo metodologico
Modellazione dell'ictus nei topi: occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media attraverso l'arteria carotide esterna
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ictus è la terza causa più comune di mortalità e la principale causa di disabilità acquisita negli adulti nei paesi sviluppati. Ad oggi, le opzioni terapeutiche sono limitate a una piccola percentuale di pazienti con ictus entro le prime ore dopo l'ictus. Nuove strategie terapeutiche sono state ampiamente studiate, soprattutto per prolungare la finestra temporale terapeutica. Queste indagini attuali includono lo studio di importanti percorsi fisiopatologici dopo l'ictus, come l'infiammazione post-ictus, l'angiogenesi, la plasticità neuronale e la rigenerazione. Nell'ultimo decennio, c'è stata una crescente preoccupazione per la scarsa riproducibilità dei risultati sperimentali e dei risultati scientifici tra i gruppi di ricerca indipendenti. Per superare la cosiddetta "crisi della replicazione", sono urgentemente necessari modelli standardizzati dettagliati per tutte le procedure. Come sforzo all'interno del consorzio di ricerca "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/), viene proposto un modello murino standardizzato di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media (MCAo). Questo modello consente il completo ripristino del flusso sanguigno al momento della rimozione del filamento, simulando la lisi del coagulo terapeutica o spontanea che si verifica in gran parte degli ictus umani. La procedura chirurgica di questo modello di corsa "filamentosa" e gli strumenti per la sua analisi funzionale sono dimostrati nel video di accompagnamento.
Introduzione
L'ictus è una delle cause più comuni di morte e disabilità in tutto il mondo. Sebbene ci siano principalmente due forme distinte di ictus, ischemico ed emorragico, l'80-85% di tutti i casi di ictus sono ischemici1. Attualmente, sono disponibili solo due trattamenti per i pazienti con ictus ischemico: trattamento farmacologico con attivatore di plasminogeno tissutale ricombinante (rtPA) o trombectomia meccanica. Tuttavia, a causa della ristretta finestra temporale terapeutica e dei molteplici criteri di esclusione, solo un numero selezionato di pazienti può beneficiare di queste specifiche opzioni di trattamento. Negli ultimi due decenni, la ricerca preclinica e traslazionale sull'ictus si è concentrata sullo studio degli approcci neuroprotettivi. Tuttavia, tutti i composti che hanno raggiunto gli studi clinici non hanno finora mostrato miglioramenti per il paziente2.
Poiché i modelli in vitro non possono riprodurre con precisione tutte le interazioni cerebrali e i meccanismi fisiopatologici dell'ictus, i modelli animali sono cruciali per la ricerca preclinica sull'ictus. Tuttavia, imitare tutti gli aspetti dell'ictus ischemico umano in un singolo modello animale non è fattibile, poiché l'ictus ischemico è una malattia altamente complessa ed eterogenea. Per questo motivo, diversi modelli di ictus ischemico sono stati sviluppati nel tempo in diverse specie. La fototrombosi delle arteriole cerebrali o l'occlusione distale permanente dell'arteria cerebrale media (MCA) sono modelli comunemente usati che inducono lesioni piccole e localmente definite nella neocorteccia3,4. Oltre a questi, il modello di corsa più comunemente usato è probabilmente il cosiddetto "modello a filamento", in cui si ottiene un'occlusione transitoria di MCA. Questo modello consiste in un'introduzione transitoria di un filamento di sutura all'origine dell'MCA, che porta ad una brusca riduzione del flusso sanguigno cerebrale e al conseguente grande infarto delle regioni cerebrali sottocorticali e corticali5. Sebbene la maggior parte dei modelli di corsa imiti le occlusioni MCA 6, il "modello a filamento" consente una delimitazione precisa del tempo ischemico. La riperfusione mediante rimozione del filamento imita lo scenario clinico umano del ripristino del flusso sanguigno cerebrale dopo la lisi del coagulo spontanea o terapeutica (rtPA o trombectomia meccanica). Ad oggi, sono state descritte diverse modifiche di questo "modello di filamento". Nell'approccio più comune, descritto per la prima volta da Longa et al. nel 19895,un filamento rivestito di silicio viene introdotto attraverso l'arteria carotide comune (CCA) all'origine dell'MCA7. Sebbene sia un approccio ampiamente utilizzato, questo modello non consente il ripristino completo del flusso sanguigno durante la riperfusione, poiché il CCA viene legato in modo permanente dopo la rimozione del filamento.
Negli ultimi dieci anni, un numero crescente di gruppi di ricerca è stato interessato a modellare l'ictus nei topi utilizzando questo "modello di filamento". Tuttavia, la notevole variabilità di questo modello e la mancanza di standardizzazione delle procedure sono alcune delle ragioni dell'elevata variabilità e scarsa riproducibilità dei risultati sperimentali e dei risultati scientifici riportati finora2,8. Una potenziale causa dell'attuale "crisi di replicazione", riferendosi alla bassa riproducibilità tra i laboratori di ricerca, è la volumi di infarto dell'ictus non comparabili tra gruppi di ricerca che utilizzano la stessa metodologia sperimentale9. Infatti, dopo aver condotto il primo studio preclinico randomizzato controllato multicentrico10,siamo stati in grado di confermare che la mancanza di una sufficiente standardizzazione di questo modello sperimentale di ictus e dei successivi parametri di esito sono stati i motivi principali del fallimento della riproducibilità negli studi preclinici tra laboratori indipendenti11 . Queste drastiche differenze nelle dimensioni dell'infarto risultanti, nonostante l'utilizzo dello stesso modello di corsa, rappresentano giustamente non solo una minaccia per la ricerca di conferma, ma anche per le collaborazioni scientifiche a causa della mancanza di modelli robusti e riproducibili.
Alla luce di queste sfide, abbiamo mirato a sviluppare e descrivere in dettaglio la procedura per un modello MCAo transitorio standardizzato utilizzato per gli sforzi di ricerca collaborativa all'interno del consorzio di ricerca "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/). Questo consorzio mira a comprendere le interazioni cervello-immunità alla base dei principi meccanicistici del recupero dell'ictus. Inoltre, vengono presentati metodi istologici e funzionali correlati per l'analisi dei risultati dell'ictus. Tutti i metodi si basano su procedure operative standard stabilite utilizzate in tutti i laboratori di ricerca del consorzio ImmunoStroke.
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Protocollo
Gli esperimenti riportati in questo video sono stati condotti seguendo le linee guida nazionali per l'uso di animali da esperimento e i protocolli sono stati approvati dai comitati governativi tedeschi (Regierung von Oberbayern, Monaco di Baviera, Germania). I topi maschi C57Bl/6J di dieci settimane sono stati utilizzati e alloggiati a temperatura controllata (22 ± 2 °C), con un periodo di ciclo luce-buio di 12 ore e accesso a cibo e acqua pellettati ad libitum.
1. Preparazione del materiale e degli strumenti
- Collegare la coperta termica per mantenere la temperatura dell'area operativa e la temperatura corporea del mouse durante l'anestesia a 37 °C.
- Forbici e pinze per autoclave, preparare una soluzione di etanolo al 70% e tenere a disposizione unguento per occhi di dexpantenolo, diversi pezzi di cotone e sutura in poliestere intrecciato rivestito 5-0 pronto per l'uso. Preparare una siringa da 1 mL con soluzione salina allo 0,9% (senza ago) per mantenere idratato il sito di incisione dell'animale. Preparare il gas di anestesia (100% O2 + isoflurano).
- Preparare un supporto per la sonda laser Doppler tagliando la punta di una punta del pipetto da 10 μL (lunghezza 3-5 mm).
NOTA: Tutti gli strumenti sono sterilizzati utilizzando uno sterilizzatore a caldo. Le superfici vengono anche disinfettate prima e dopo l'intervento chirurgico con uno spray disinfettante microbico. Prima dell'intervento chirurgico, le aree che circondano la testa e il torace dei topi vengono disinfettate con uno spray per la disinfezione delle ferite.
2. Preparazione del laser Doppler
- Iniettare analgesia al topo 30 minuti prima dell'intervento chirurgico (4 mg/kg di Carprofene e 0,1 mg/kg di Buprenorfina, per via intraperitoneale).
- Anestetizzare il topo posizionandolo nella camera di induzione con una portata isoflurano del 4% fino alla cessazione del movimento spontaneo del corpo e delle vibrisse.
- Posizionare il mouse in posizione prona nell'area operativa con il naso nella maschera di anestesia. Mantenere la concentrazione di isoflurano al 4% per un altro minuto, quindi ridurla e mantenerla al 2%.
- Impostare la piastra riscaldante a feedback controllata associata per mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C e inserire delicatamente la sonda rettale per monitorare la temperatura durante le procedure chirurgiche.
- Applicare l'unguento per gli occhi di dexpantenolo su entrambi gli occhi.
- Disinfettare la pelle e i capelli che circondano l'occhio sinistro e l'orecchio con il 70% di etanolo.
- Tagliare il cuoio capelluto tra l'orecchio sinistro e l'occhio (lungo 1 cm) per esporre l'osso del cranio.
- Taglia e ritira il muscolo temporale per visualizzare l'MCA sotto il cranio.
- Fissare con colla la parte esterna della punta tenendo la sonda / fibra Doppler laser sopra l'MCA sinistro con colla. Quindi, incollare la pelle per chiudere la ferita attorno al supporto della punta. Applicare 2-3 gocce di colla indurente per accelerare il processo. Assicurarsi che la fibra Laser Doppler non sia incollata e possa essere facilmente rimossa dal supporto della punta in qualsiasi momento.
3. Modello MCAo transitorio (occlusione)
- Ruotare il mouse in posizione supina. Metti il muso nel cono di anestesia e fissa le zampe con del nastro adesivo.
- Disinfettare la pelle e i capelli che circondano il torace e fare un'incisione della linea mediana lunga 2 cm nel collo.
- Utilizzare una pinza per separare la pelle e le ghiandole sottomandibolari. Utilizzare divaricatori per tenere il muscolo sternomastoideo, esporre il campo chirurgico e trovare l'arteria carotide comune sinistra (CCA). Sezionare il CCA libero dal tessuto connettivo e dai nervi circostanti (senza danneggiare il nervo vagale) ed eseguire una legatura transitoria prima della biforcazione.
- Sezionare l'arteria carotide esterna (ECA) e legare un nodo permanente nella parte visibile più distale. Posizionare un'altra sutura sotto l'ECA, vicino alla biforcazione, e preparare un nodo sciolto da utilizzare in seguito.
- Sezionare l'arteria carotide interna (ICA) e posizionare una clip microvascolare su di essa, 5 mm sopra la biforcazione. Assicurati di non danneggiare il nervo vagale.
- Tagliare un piccolo foro nell'ECA tra le legature strette e sciolte; fare attenzione a non tagliare l'intera Corte dei conti europea.
- Introdurre il filamento e farlo avanzare verso il CCA. Stringere la legatura allentata nell'ECA attorno al lume per fissare brevemente il filamento in quella posizione ed evitare sanguinamenti durante la rimozione della clip microvascolare.
- Rimuovere la clip microvascolare e inserire il filamento attraverso l'ICA fino a raggiungere l'origine dell'MCA rilevando una forte riduzione (>80%) del flusso sanguigno cerebrale misurato dal laser Doppler. Fissare il filamento in questa posizione stringendo ulteriormente il nodo attorno all'ECA.
NOTA: quando il filamento va verso la direzione appropriata, avanza senza intoppi e non deve essere osservata alcuna resistenza. - Registrare i valori Doppler laser prima e dopo l'inserimento del filamento.
- Rimuovere il divaricatore e spostare il muscolo sternomastoideo e le ghiandole sottomandibolari prima di suturare la ferita. Rimuovere la sonda laser Doppler e posizionare l'animale in una camera di recupero a 37 °C per 1 ora (fino alla rimozione del filamento).
4. Modello MCAo transitorio (riperfusione)
- Anestetizzare il topo posizionandolo nella camera di induzione con una portata isoflurano del 4% fino alla cessazione del movimento spontaneo del corpo e delle vibrisse.
- Applicare l'unguento per gli occhi di dexpantenolo su entrambi gli occhi.
- Posizionare il mouse in posizione prona nell'area operativa con il muso nella maschera di anestesia. Mantenere la concentrazione di isoflurano al 4% per un altro minuto, quindi ridurla e mantenerla al 2%. Fissa le zampe dell'animale con del nastro adesivo.
- Inserire la sonda laser Doppler nel supporto della sonda.
- Rimuovere la sutura della ferita, utilizzare una pinza per separare la pelle e le ghiandole sottomandibolari. Utilizzare divaricatori per tirare delicatamente il muscolo sternomastoideo ed esporre il campo chirurgico.
- Allentare la sutura ECA che stringe il filamento e tirare delicatamente il filamento. Evitare di danneggiare il rivestimento in gomma siliconica del filamento durante la rimozione.
- Legare strettamente la sutura ECA.
- Confermare l'aumento del flusso sanguigno cerebrale nel dispositivo laser Doppler (>80% del valore iniziale prima della riperfusione).
- Registrare i valori Doppler laser prima e dopo la rimozione del filamento.
- Aprire la legatura transitoria prima della biforcazione dal CCA.
- Rimuovere il riavvolgitore e spostare il muscolo sternomastoideo e le ghiandole sottomandibolari prima di suturare la ferita. Mettere l'animale in una camera di recupero a 37 °C per 1 ora per riprendersi dall'anestesia.
- Dopo il recupero, riportare i topi nelle loro gabbie in una stanza a temperatura controllata.
- Prenditi cura degli animali aggiungendo pellet di cibo umido e idrogel in piccole piastre di Petri sul pavimento della gabbia fino al giorno 3 dopo l'intervento.
- Iniettare analgesia ogni 12 ore per 3 d dopo l'intervento chirurgico (4 mg/kg di Carprofene e 0,1 mg/kg di Buprenorfina).
5. Operazione fittizia
- Eseguire tutte le procedure come descritto sopra, compresa la legatura delle arterie e l'introduzione del filamento (passaggi 1-3.7).
- Rimuovere il filamento immediatamente dopo il suo inserimento. Quindi, posizionare l'animale nella camera di recupero per 1 ora.
- Posizionare nuovamente l'animale nell'area operativa e rimuovere la legatura transitoria del CCA per garantire il completo ripristino del flusso sanguigno cerebrale.
- Suturare la ferita e mettere l'animale in una camera di recupero a 37 °C per 1 ora per riprendersi dall'anestesia. Dopo il recupero, riportare i topi nelle loro gabbie in una stanza a temperatura controllata.
- Prenditi cura degli animali aggiungendo pellet di cibo umido e idrogel in piccole piastre di Petri sul pavimento della gabbia fino al giorno 3 dopo l'intervento chirurgico.
- Iniettare analgesia ogni 12 ore per 3 d dopo l'intervento chirurgico (4 mg/kg di Carprofene e 0,1 mg/kg di Buprenorfina).
6. Neuropunteggio
- Esegui il Neuroscore sempre alla stessa ora del giorno e usa abiti chirurgici per mantenere un "odore neutro" tra i singoli chirurghi.
- Lasciare riposare i topi per 30 minuti nella stanza con una gabbia "aperta" prima del test.
- Osservare ogni elemento della tabella 1 e della tabella 2 per 30 s.
7. Perfusione intracardiaca
- Preparare una siringa da 20 mL contenente eparina tamponata con fosfato (PBS) (2 U/mL) e posizionarla 1 m sopra il banco per facilitare la perfusione per gravità. (OPZIONALE: Eseguire la perfusione intracardiaca con paraformaldeide al 4% (PFA) utilizzando una siringa da 20 mL contenente il 4% di PFA in PBS, pH 7,4).
- Iniettare intrperitoneally 100 μL di ketamina e xilazina (rispettivamente 120 e 16 mg/kg di peso corporeo). Attendere 5 minuti e confermare la cessazione del movimento spontaneo del corpo e delle vibrisse.
- Fissare l'animale in posizione supina e disinfettare la superficie addominale del corpo con etanolo al 70%.
- Fai un'incisione lunga 3 cm nell'addome; tagliare il diaframma, le costole e lo sterno per visualizzare completamente il cuore.
- Fai una piccola incisione nell'atrio destro e inserisci la cannula di perfusione nel ventricolo sinistro.
- Perfondere con 20 ml di PBS-eparina.
- Dopo la perfusione, decapitare l'animale e rimuovere il cervello.
- Congelare il cervello su ghiaccio secco in polvere e conservare a -80 °C fino a nuovo utilizzo.
8. Volumetria dell'infarto
- Per la criosezione, utilizzare un criostato per tagliare il cervello in sezioni spesse 20 μm ogni 400 μm. Posizionare le sezioni sulle diapositive e conservare le diapositive a -80 °C fino all'uso.
- Colorazione viola cresile (CV)
- Preparare la soluzione colorante mescolando e riscaldando (60 °C) 0,5 g di acetato CV in 500 mL di H2O fino a quando i cristalli non si sono sciolti. Dopo che la soluzione si è raffreddata, conservarla in una bottiglia scura. Riscaldare a 60 °C e filtrare prima di ogni utilizzo.
- Lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti. Immergerli in etanolo al 95% per 15 minuti, in etanolo al 70% per 1 minuto e poi in etanolo al 50% per 1 minuto.
- Immergere gli scivoli in acqua distillata per 2 min; rinfrescare l'acqua distillata e mettere i vetrini nell'acqua per 1 min. Successivamente, immergere i vetrini nella soluzione colorante preriscaldata per 10 minuti a 60 °C. Lavare i vetrini due volte in acqua distillata per 1 min.
- Immergere le diapositive in etanolo al 95% per 2 min. Metterli in etanolo al 100% per 5 min; rinfrescare l'etanolo al 100% e posizionare nuovamente i vetrini nell'etanolo per 2 minuti. Successivamente, coprire le diapositive con un mezzo di montaggio.
- Analisi (Figura 4C)
- Scansiona le diapositive e analizza il volume indiretto dell'infarto con il metodo Swanson12 per correggere l'edema usando la seguente equazione:
(Area ischemica) = (regione ischemica)-((emisfero ipsilaterale)-(emisfero controlaterale))
- Scansiona le diapositive e analizza il volume indiretto dell'infarto con il metodo Swanson12 per correggere l'edema usando la seguente equazione:
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Risultati
Il modello qui descritto è una modifica del modello di corsa "filamento" comunemente usato, che consiste nell'introdurre un filamento rivestito di silicio attraverso l'ECA per bloccare transitoriamente l'origine dell'MCA (Figura 1). Dopo aver rimosso il filamento, solo il flusso sanguigno nell'ECA viene definitivamente interrotto, consentendo la completa ricanalizzazione del CCA e dell'ICA. Ciò consente un'adeguata riperfusione del cervello (Figura 2), simile al...
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Discussione
Il presente protocollo descrive un modello sperimentale di ictus basato sull'accordo di consenso di un consorzio di ricerca multicentrico tedesco ("ImmunoStroke") per stabilire un modello MCAo transitorio standardizzato. Il modello MCAo transitorio stabilito introducendo un filamento rivestito di silicio attraverso l'ECA all'origine dell'MCA è uno dei modelli di ictus più utilizzati per ottenere la riperfusione arteriosa dopo un periodo di occlusione delimitato. Pertanto, questa procedura può essere considerata un modell...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi concorrenti da divulgare.
Ringraziamenti
Ringraziamo tutti i nostri partner di collaborazione dei Consorzi ImmunoStroke (FOR 2879, Dalle cellule immunitarie al recupero dell'ictus) per suggerimenti e discussioni. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) nell'ambito della strategia di eccellenza della Germania nell'ambito del Cluster for Systems Neurology di Monaco (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) e nell'ambito delle sovvenzioni LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 e LL-112/1-1.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 45 gradi | rampa H& S Kunststofftechnik | altezza: 18 cm | |
| 5/0 minaccia | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL siringa | Braun | ||
| Acido acetico | Sigma Life Science | 695092 | |
| Sistema di anestesia per isoflurano | Dräger | ||
| Bepanthen pomata | Bayer | ||
| C57Bl/6J topi | Charles Morsetto | 000664 | |
| FST | 12500-12 | ||
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Porta clip | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Etanolo 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Etanolo 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Etanolo 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filamenti | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 pinze angolate | FST | 11251-35 | |
| Pinze fini | FST | 11252-23 | |
| Forbici fini | FST | 14094-11 | |
| Colla | Orechseln | BSI-112 | |
| Colla indurente | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Coperta riscaldante | FHC DC Regolatore | ||
| di temperatura Isoflurano | Abbot | B506 | |
| Isopentano | Fluka | 59070 | |
| Ketamina | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Sonda Laser Doppler | Perimed | 91-00123 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato pH: 7,4 | Apotheke Innestadt Uni München | P32799 | |
| Camera di recupero | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mezzo di montaggio | Roth | 6638.1 | |
| Soluzione salina | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Filamenti siliconati | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xilacino | Albrecht |
Riferimenti
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