Le tecniche di microiniezione sono essenziali per introdurre geni esogeni nei genomi delle zanzare. Questo protocollo spiega un metodo utilizzato dal laboratorio James per microiniettare costrutti di DNA in embrioni di Anopheles gambiae per generare zanzare trasformate.
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Articolo metodologico
Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le tecniche di microiniezione degli embrioni sono essenziali per molti studi molecolari e genetici sulle specie di insetti. Forniscono un mezzo per introdurre frammenti di DNA esogeni che codificano geni di interesse e tratti favorevoli nella linea germinale degli insetti in modo stabile ed ereditabile. I ceppi transgenici risultanti possono essere studiati per i cambiamenti fenotipici derivanti dall'espressione del DNA integrato per rispondere a domande di base o utilizzati in applicazioni pratiche. Sebbene la tecnologia sia semplice, richiede all'investigatore pazienza e pratica per raggiungere un livello di abilità che massimizzi l'efficienza. Mostrato qui è un metodo per la microiniezione di embrioni della zanzara africana della malaria, Anopheles gambiae. L'obiettivo è quello di fornire per microiniezione DNA esogeno all'embrione in modo che possa essere assorbito nelle cellule germinali (polo) in via di sviluppo. L'espressione dal DNA iniettato di trasposasi, integrasi, ricombinasi o altre nucleasi (ad esempio proteine associate a CRISPR, Cas) può innescare eventi che portano al suo inserimento covalente nei cromosomi. Transgenic An. gambiae generato da queste tecnologie sono stati utilizzati per studi di base di componenti del sistema immunitario, geni coinvolti nell'alimentazione del sangue ed elementi del sistema olfattivo. Inoltre, queste tecniche sono state utilizzate per produrre ceppi di An. gambiae con tratti che possono aiutare a controllare la trasmissione dei parassiti della malaria.
Introduzione
Le tecniche di microiniezione sono state utilizzate per manipolare sperimentalmente gli organismi fin dai primi anni del 19001. La microiniezione è stata utilizzata per studiare sia le funzioni biologiche di base che per introdurre importanti cambiamenti nella biologia di un organismo desiderato. La tecnica di microiniezione è stata di particolare interesse per i biologi vettori ed è stata ampiamente utilizzata per manipolare i genomi vettoriali2-11. Gli esperimenti di transgenesi nei vettori di artropodi spesso mirano a rendere i vettori meno efficienti nella trasmissione di agenti patogeni attua....
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Protocollo
1. Preparare le zanzare per la microiniezione
- Semina una gabbia13 (~ 5000 cm3) con ~ 100 maschi e 200-300 femmine 1-2 giorni zanzare adulte post-eclosion e lascia loro accoppiare per 2 giorni.
- Dopo il periodo dell'accoppiamento, fornire alle zanzare un pasto di sangue utilizzando 2 ml di sangue con un dispositivo di alimentazione artificiale o animali vivi anestetizzati a seconda delle pratiche insetticide14. Il giorno seguente fornisci alle zanzare un secondo pasto di sangue per garantire che tutte le femmine accoppiate abbiano avuto l'opportunità di nutrirsi e che le zanzare parzialmente ....
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Risultati
Un esempio rappresentativo dell'applicazione del protocollo di microiniezione descritto può essere trovato in Carballar-Lejarazú et al5. L'intento qui era quello di inserire un sistema autonomo di gene-drive nella linea germinale di un ceppo di laboratorio, G3, di An. gambiae. Il sistema è stato progettato per colpire il locus ortologo cardinale (Agcd) sul terzo cromosoma in questa specie, che codifica per un'eme perossidasi che catalizza la conversione della 3-idrossich.......
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Discussione
Con la maggiore disponibilità di tecnologie di ingegneria genetica precise e flessibili come CRISPR / Cas9, gli organismi transgenici possono essere sviluppati in modo più semplice e stabile di quanto fosse possibile in precedenza. Questi strumenti hanno permesso ai ricercatori di creare ceppi transgenici di vettori di zanzare che sono molto vicini a raggiungere le proprietà desiderate di refrattarietà ai patogeni (modifica della popolazione) o sterilità ereditaria (soppressione della popolazione). Tuttavia, per sviluppa.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell e Madeline Nottoli per l'allevamento delle zanzare. Il finanziamento è stato fornito dall'Università della California, Irvine Malaria Initiative. AAJ è donald bren professor presso l'Università della California, Irvine.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10x tampone per microiniezione | - | -1 mM NaHPO4 tampone, pH 6,8, 50 mM KCl | |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Tagliato in modo ordinato e dritto in 2x1 cm | |
| provette coniche da 50 ml (provetta da centrifuga monouso, polipropilene) | Fisher Brand | Estremità tagliate | |
| Acqua deionizzata o bidistillata (ddH20) | Mili-Q | In una bottiglia di lavaggio | |
| Microscopio da dissezione | Leica | Leica MZ12 | Per l'allineamento dell'embrione |
| Pinze | N. 5 dimensioni | ||
| Contenitore di vetro | Pyrex | n. 3140 | 125 x 65 |
| Vetrino | Fisher Marca | n. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubatrice | Barnsted Lab-line | Modello n. 150 | 28 gradi C |
| KCl | 50 mM | ||
| Pellicola dentale in lattice | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microiniettore | Sutter Strumento | XenoWorks Microiniettore digitale | |
| Microloader Punte per pipette | Eppendorf | 20 µ microloader a L epT.I.P.S. | |
| Micromanipolatore | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipolatore | |
| Micropipetta | Rainin | 20 µ L | |
| Estrattore per micropipette | Sutter Instrument | micropipette Sutter P-2000 | |
| Microscopio | Leica | DM 1000 LED o M165 FC | Per |
| microiniezione Carta da filtro in fibra minima | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Carta per cromatografia, spessa |
| Zanzare | MR4, BEI Risorse Anopheles | gambiae, femmine adulte accoppiate, alimentate con sangue 4-5 giorni dopo l'eclosion | |
| NaHPO4 tampone | 1 mM, ph 6,8 | ||
| Rete | |||
| Pennello | Blick | n. 05831-7040 | Fine, misura 4/0 |
| Piastra | Plastica, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Acetato | |||
| Capillari in vetro di quarzo 3M | Strumento Sutter | n. QF100-70-10 | Con filamento, diametro esterno 1 mm, ID 0,7 10 cm di lunghezza |
| Grado PCR ad acqua | Roche | n. 03315843001 |
Riferimenti
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in ....
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Ristampe e permessi
