Articolo metodologico

Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione

DOI:

10.3791/62594

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8 luglio 2021

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1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopedic Surgery, University Hospital of Tübingen, 2Department of Orthopedic Surgery, University Hospital of Tübingen, 3Institute for Bioinformatics and Medical Informatics, Faculty of science of the University of Tübingen, 4Medical faculty of the University of Tübingen, 5Bavarian Health and Food Safety Authority

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un metodo per studiare l'organizzazione spaziale dei condrociti nell'anulus fibrosus del disco intervertebrale utilizzando un metodo di sezionamento ottico.

Abstract

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La degenerazione del disco intervertebrale (IVD) è una delle principali cause di lombalgia e comporta un alto grado di compromissione per gli individui colpiti. Per decodificare la degenerazione del disco e per essere in grado di sviluppare approcci rigenerativi è essenziale una conoscenza approfondita della biologia cellulare dell'IVD. Un aspetto di questa biologia che rimane ancora senza risposta è la domanda su come le cellule sono disposte spazialmente in uno stato fisiologico e durante la degenerazione. Le proprietà biologiche dell'IVD e la sua disponibilità rendono questo tessuto difficile da analizzare. Il presente studio indaga l'organizzazione spaziale dei condrociti nell'anulus fibroso dallo sviluppo embrionale precoce alla degenerazione allo stadio terminale. Un metodo di sezionamento ottico (Apotome) viene applicato per eseguire analisi di colorazione ad alta risoluzione utilizzando tessuto embrionale bovino come modello animale e tessuto del disco umano ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale. Da una densità di condrociti molto elevata nel disco bovino embrionale precoce, il numero di cellule diminuisce durante la gestazione, la crescita e la maturazione. Nei dischi umani, un aumento della densità cellulare ha accompagnato la progressione della degenerazione tissutale. Come era già stato dimostrato nella cartilagine articolare, la formazione di cluster rappresenta una caratteristica della degenerazione avanzata del disco.

Introduzione

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Il disco intervertebrale (IVD) è una struttura a base di cartilagine che biochimicamente e rispetto all'architettura cellulare, a prima vista, assomiglia per molti versi alla cartilaginearticolare 1. Infatti, sia la degenerazione IVD che l'osteoartrite (OA) della cartilagine articolare sono caratterizzate da restringimento dello spazio articolare a causa dell'usura della cartilagine, della cisti subcondrale e della formazione di osteofiti e della sclerosi subcondrale2,3. Nonostante queste apparenti somiglianze, l'architettura e il ruolo funzionale di entrambi i tessuti differiscono. Men....

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Protocollo

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Per l'analisi dello sviluppo e della maturazione embrionale sono stati utilizzati dischi bovini. Per valutare la degenerazione dell'IVD, sono stati analizzati campioni umani.

Il tessuto IVD umano è stato ottenuto da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per degenerazione del disco lombare, prolasso del disco o trauma spinale nel Dipartimento di Chirurgia Ortopedica, nell'Ospedale Universitario di Tubinga e nel BG Trauma Centre Tübingen. La piena approvazione del comitato etico è stata ottenuta prima dell'inizio dello studio (numero di progetto 244/2013BO2). Il consenso informato scritto è stato ricevuto da tutti i pazienti prima della....

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Risultati

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Utilizzando immagini a mosaico, l'architettura dell'IVD con la sua fitta rete di fibre di collagene nell'anolo e il nucleo più morbido può essere chiaramente riconosciuta (Figura 4). Una continua diminuzione della densità cellulare può essere osservata durante lo sviluppo embrionale (Figura 5). Mentre nelle prime fasi dello sviluppo dell'IVD si può trovare una densità cellulare di 11.435 cellule/mm² nell'anulus fibrosus bovino e 17.426 cellule/mm² nel nucleo pol.......

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Discussione

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Utilizzando la microscopia a fluorescenza aumentata dall'imaging a mosaico e dal sezionamento ottico, abbiamo valutato la disposizione spaziale dei condrociti nell'anoulus dell'IVD lombare durante lo sviluppo, la maturazione e la degenerazione. Mentre il tessuto degenerativo poteva essere raccolto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale per la degenerazione del disco, l'analisi del periodo embrionale e della fase di maturazione richiedeva l'uso di un organismo modello (bovino). Alte densità cellulari .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo i nostri co-autori delle pubblicazioni originali per il loro aiuto e supporto. Ringraziamo Charlotte Emma Bamberger per aver contribuito ad acquisire le immagini dell'apotoma.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Amfotericina BMerck KGaA,  GermaniaA2942
Vetrini per microscopio ad adesione SuperFrost PlusR. Langenbrinck, Germania03-0060
ApoTomeCarl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania462000115
AxioVision Rel. 4.8 con Modul MosaiXCarl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania
CellMask Actin Tracking StainThermo Fischer Scientific, USA57249
CriostatoLeica Biosystems, USCM3050S
DAPIThermo Fischer Scientific, USD1306
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)Gibco, Life Technologies, Germania41966052
Acido etilendiamminotetraaceticoSigma-Aldrich, US60004
Miscoscopio a fluorescenza - Axio Observer Z1 con Axio Cam MR3 e ColibriCarl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania3834000604
FormaldeideMerck KGaA,  Germania104002
Immagine J 1.53a, con contatore di cellule pluginNational Insittute of Health (NIH), Stati Uniti
Invitrogen Alexa Fluor 568 PhalloidinThermo Fischer Scientific, Stati UnitiA12380
Microscopic Cover GlassesR. Langenbrinck, Germania01-1818/1
PAP Pen Liquid BlockerScience Sevices  GmbH, GermaniaN71310
Penicillina-StreptomicinaSigma-Aldrich, USP4333
Soluzione salina tamponata con fosfatoSigma-Aldrich, USP5119
Scalpelpf medical AG, Germania2023-01
Tissue-tek O.C.T. CompoundSakura Finetek,Paesi Bassi SA6255012

Riferimenti

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  1. Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
  2. Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004....

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Degenerazione discaleorganizzazione dei condrocitiimaging a mosaicomicroscopia a fluorescenzaanalisi della densit cellulareanulus fibrosusnucleo polposo

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