Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione

Summary

Presentiamo un metodo per studiare l'organizzazione spaziale dei condrociti nell'anulus fibrosus del disco intervertebrale utilizzando un metodo di sezionamento ottico.

Abstract

La degenerazione del disco intervertebrale (IVD) è una delle principali cause di lombalgia e comporta un alto grado di compromissione per gli individui colpiti. Per decodificare la degenerazione del disco e per essere in grado di sviluppare approcci rigenerativi è essenziale una conoscenza approfondita della biologia cellulare dell'IVD. Un aspetto di questa biologia che rimane ancora senza risposta è la domanda su come le cellule sono disposte spazialmente in uno stato fisiologico e durante la degenerazione. Le proprietà biologiche dell'IVD e la sua disponibilità rendono questo tessuto difficile da analizzare. Il presente studio indaga l'organizzazione spaziale dei condrociti nell'anulus fibroso dallo sviluppo embrionale precoce alla degenerazione allo stadio terminale. Un metodo di sezionamento ottico (Apotome) viene applicato per eseguire analisi di colorazione ad alta risoluzione utilizzando tessuto embrionale bovino come modello animale e tessuto del disco umano ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale. Da una densità di condrociti molto elevata nel disco bovino embrionale precoce, il numero di cellule diminuisce durante la gestazione, la crescita e la maturazione. Nei dischi umani, un aumento della densità cellulare ha accompagnato la progressione della degenerazione tissutale. Come era già stato dimostrato nella cartilagine articolare, la formazione di cluster rappresenta una caratteristica della degenerazione avanzata del disco.

Introduction

Il disco intervertebrale (IVD) è una struttura a base di cartilagine che biochimicamente e rispetto all'architettura cellulare, a prima vista, assomiglia per molti versi alla cartilagine^{articolare 1.} Infatti, sia la degenerazione IVD che l'osteoartrite (OA) della cartilagine articolare sono caratterizzate da restringimento dello spazio articolare a causa dell'usura della cartilagine, della cisti subcondrale e della formazione di osteofiti e della sclerosi subcondrale^2,3. Nonostante queste apparenti somiglianze, l'architettura e il ruolo funzionale di entrambi i tessuti differiscono. Men....

Protocol

Per l'analisi dello sviluppo e della maturazione embrionale sono stati utilizzati dischi bovini. Per valutare la degenerazione dell'IVD, sono stati analizzati campioni umani.

Il tessuto IVD umano è stato ottenuto da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per degenerazione del disco lombare, prolasso del disco o trauma spinale nel Dipartimento di Chirurgia Ortopedica, nell'Ospedale Universitario di Tubinga e nel BG Trauma Centre Tübingen. La piena approvazione del comitato etico è stata ottenuta prima dell'inizio dello studio (numero di progetto 244/2013BO2). Il consenso informato scritto è stato ricevuto da tutti i pazienti prima della....

Results

Utilizzando immagini a mosaico, l'architettura dell'IVD con la sua fitta rete di fibre di collagene nell'anolo e il nucleo più morbido può essere chiaramente riconosciuta (Figura 4). Una continua diminuzione della densità cellulare può essere osservata durante lo sviluppo embrionale (Figura 5). Mentre nelle prime fasi dello sviluppo dell'IVD si può trovare una densità cellulare di 11.435 cellule/mm² nell'anulus fibrosus bovino e 17.426 cellule/mm² nel nucleo pol.......

Discussion

Utilizzando la microscopia a fluorescenza aumentata dall'imaging a mosaico e dal sezionamento ottico, abbiamo valutato la disposizione spaziale dei condrociti nell'anoulus dell'IVD lombare durante lo sviluppo, la maturazione e la degenerazione. Mentre il tessuto degenerativo poteva essere raccolto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale per la degenerazione del disco, l'analisi del periodo embrionale e della fase di maturazione richiedeva l'uso di un organismo modello (bovino). Alte densità cellulari .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amfotericina B	Merck KGaA,  Germania	A2942
Vetrini per microscopio ad adesione SuperFrost Plus	R. Langenbrinck, Germania	03-0060
ApoTome	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania	462000115
AxioVision Rel. 4.8 con Modul MosaiX	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania
CellMask Actin Tracking Stain	Thermo Fischer Scientific, US	A57249
Criostato	Leica Biosystems, US	CM3050S
DAPI	Thermo Fischer Scientific, US	D1306
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Germania	41966052
Acido etilendiamminotetraacetico	Sigma-Aldrich, US	60004
Miscoscopio a fluorescenza - Axio Observer Z1 con Axio Cam MR3 e Colibri	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania	3834000604
Formaldeide	Merck KGaA,  Germania	104002
Immagine J 1.53a, con contatore di cellule plugin	National Insittute of Health (NIH), Stati Uniti
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin	Thermo Fischer Scientific, Stati Uniti	A12380
Microscopic Cover Glasses	R. Langenbrinck, Germania	01-1818/1
PAP Pen Liquid Blocker	Science Sevices  GmbH, Germania	N71310
Penicillina-Streptomicina	Sigma-Aldrich, US	P4333
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich, US	P5119
Scalpel	pf medical AG, Germania	2023-01
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek,	Paesi Bassi SA6255012