Presentiamo un metodo per studiare l'organizzazione spaziale dei condrociti nell'anulus fibrosus del disco intervertebrale utilizzando un metodo di sezionamento ottico.
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Articolo metodologico
Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La degenerazione del disco intervertebrale (IVD) è una delle principali cause di lombalgia e comporta un alto grado di compromissione per gli individui colpiti. Per decodificare la degenerazione del disco e per essere in grado di sviluppare approcci rigenerativi è essenziale una conoscenza approfondita della biologia cellulare dell'IVD. Un aspetto di questa biologia che rimane ancora senza risposta è la domanda su come le cellule sono disposte spazialmente in uno stato fisiologico e durante la degenerazione. Le proprietà biologiche dell'IVD e la sua disponibilità rendono questo tessuto difficile da analizzare. Il presente studio indaga l'organizzazione spaziale dei condrociti nell'anulus fibroso dallo sviluppo embrionale precoce alla degenerazione allo stadio terminale. Un metodo di sezionamento ottico (Apotome) viene applicato per eseguire analisi di colorazione ad alta risoluzione utilizzando tessuto embrionale bovino come modello animale e tessuto del disco umano ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale. Da una densità di condrociti molto elevata nel disco bovino embrionale precoce, il numero di cellule diminuisce durante la gestazione, la crescita e la maturazione. Nei dischi umani, un aumento della densità cellulare ha accompagnato la progressione della degenerazione tissutale. Come era già stato dimostrato nella cartilagine articolare, la formazione di cluster rappresenta una caratteristica della degenerazione avanzata del disco.
Introduzione
Il disco intervertebrale (IVD) è una struttura a base di cartilagine che biochimicamente e rispetto all'architettura cellulare, a prima vista, assomiglia per molti versi alla cartilaginearticolare 1. Infatti, sia la degenerazione IVD che l'osteoartrite (OA) della cartilagine articolare sono caratterizzate da restringimento dello spazio articolare a causa dell'usura della cartilagine, della cisti subcondrale e della formazione di osteofiti e della sclerosi subcondrale2,3. Nonostante queste apparenti somiglianze, l'architettura e il ruolo funzionale di entrambi i tessuti differiscono. Men....
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Protocollo
Per l'analisi dello sviluppo e della maturazione embrionale sono stati utilizzati dischi bovini. Per valutare la degenerazione dell'IVD, sono stati analizzati campioni umani.
Il tessuto IVD umano è stato ottenuto da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per degenerazione del disco lombare, prolasso del disco o trauma spinale nel Dipartimento di Chirurgia Ortopedica, nell'Ospedale Universitario di Tubinga e nel BG Trauma Centre Tübingen. La piena approvazione del comitato etico è stata ottenuta prima dell'inizio dello studio (numero di progetto 244/2013BO2). Il consenso informato scritto è stato ricevuto da tutti i pazienti prima della....
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Risultati
Utilizzando immagini a mosaico, l'architettura dell'IVD con la sua fitta rete di fibre di collagene nell'anolo e il nucleo più morbido può essere chiaramente riconosciuta (Figura 4). Una continua diminuzione della densità cellulare può essere osservata durante lo sviluppo embrionale (Figura 5). Mentre nelle prime fasi dello sviluppo dell'IVD si può trovare una densità cellulare di 11.435 cellule/mm² nell'anulus fibrosus bovino e 17.426 cellule/mm² nel nucleo pol.......
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Discussione
Utilizzando la microscopia a fluorescenza aumentata dall'imaging a mosaico e dal sezionamento ottico, abbiamo valutato la disposizione spaziale dei condrociti nell'anoulus dell'IVD lombare durante lo sviluppo, la maturazione e la degenerazione. Mentre il tessuto degenerativo poteva essere raccolto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale per la degenerazione del disco, l'analisi del periodo embrionale e della fase di maturazione richiedeva l'uso di un organismo modello (bovino). Alte densità cellulari .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i nostri co-autori delle pubblicazioni originali per il loro aiuto e supporto. Ringraziamo Charlotte Emma Bamberger per aver contribuito ad acquisire le immagini dell'apotoma.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Amfotericina B | Merck KGaA, Germania | A2942 | |
| Vetrini per microscopio ad adesione SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germania | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 con Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Criostato | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germania | 41966052 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Miscoscopio a fluorescenza - Axio Observer Z1 con Axio Cam MR3 e Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania | 3834000604 | |
| Formaldeide | Merck KGaA, Germania | 104002 | |
| Immagine J 1.53a, con contatore di cellule plugin | National Insittute of Health (NIH), Stati Uniti | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, Stati Uniti | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germania | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germania | N71310 | |
| Penicillina-Streptomicina | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma-Aldrich, US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germania | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, | Paesi Bassi SA6255012 |
Riferimenti
- Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004....
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Ristampe e permessi
