Preparazione del campione all'analisi bioinformatica della metilazione del DNA: strategia di associazione per l'obesità e studi sui tratti correlati

Sommario

Il presente studio descrive il flusso di lavoro per gestire i dati di metilazione del DNA ottenuti dalle tecnologie microarray. Il protocollo illustra i passaggi dalla preparazione del campione all'analisi dei dati. Tutte le procedure sono descritte in dettaglio e il video mostra i passaggi significativi.

Abstract

L'obesità è direttamente collegata allo stile di vita ed è stata associata a cambiamenti di metilazione del DNA che possono causare alterazioni nell'adipogenesi e nei processi di stoccaggio dei lipidi che contribuiscono allo sviluppo della malattia. Dimostriamo un protocollo completo dalla selezione all'analisi dei dati epigenetici di pazienti con e senza obesità. Tutte le fasi del protocollo sono state testate e convalidate in uno studio pilota. 32 donne hanno partecipato allo studio, in cui 15 individui sono stati classificati con obesità in base all'indice di massa corporea (BMI) (45,1 ± 5,4 kg / ^m2); e 17 individui sono stati classificati senza obesità in base al BMI (22,6 ± 1,8 kg / ^m2). Nel gruppo con obesità, 564 siti CpG correlati alla massa grassa sono stati identificati mediante analisi di regressione lineare. I siti CpG erano nelle regioni promotrici. L'analisi differenziale ha rilevato 470 CpG ipometilati e 94 siti ipermetilati in individui con obesità. Le vie arricchite più ipometilate erano nel RUNX, nella segnalazione WNT e nella risposta all'ipossia. Le vie ipermetilate erano correlate alla secrezione di insulina, alla segnalazione del glucagone e al ^Ca2+. Concludiamo che il protocollo ha identificato efficacemente i modelli di metilazione del DNA e la metilazione del DNA correlata ai tratti. Questi modelli potrebbero essere associati a un'alterata espressione genica, influenzando l'adipogenesi e l'accumulo di lipidi. I nostri risultati hanno confermato che uno stile di vita obesogenico potrebbe promuovere cambiamenti epigenetici nel DNA umano.

Introduzione

Le tecnologie omiche su larga scala sono state sempre più utilizzate negli studi sulle malattie croniche. Una caratteristica interessante di questi metodi è la disponibilità di una grande quantità di dati generati per la comunità scientifica. Pertanto, è sorta la richiesta di standardizzare i protocolli per consentire il confronto tecnico tra gli studi. Il presente studio suggerisce la standardizzazione di un protocollo per ottenere e analizzare i dati di metilazione del DNA, utilizzando uno studio pilota come esempio applicato.

Il dispendio energetico negativo predomina nei moderni stili di vita umani, portando ad un eccessivo accumulo di tessuto adiposo e, di conseguenza, allo sviluppo dell'obesità¹. Molti fattori hanno aumentato i tassi di obesità, come il sedentarismo, le diete ipercaloriche e le routine stressanti. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha stimato che 1,9 miliardi di adulti erano obesi nel 2016, il che significa che oltre il 20% della popolazione mondiale ha oltre 30 kg / ^{m2 BMI2}. L'aggiornamento più recente del 2018 ha rivelato che la prevalenza dell'obesità negli Stati Uniti d'America (USA) era superiore al 42%³.

L'epigenetica è l'adattamento strutturale delle regioni cromosomiche per registrare, segnalare o perpetuare stati di attività ^alterati4. La metilazione del DNA è un'alterazione chimica reversibile nei siti dei dinucleotidi citosina-guanosina (siti CpG), formando 5-metilcitosina-pG (5mCpG). Può modulare l'espressione genica regolando l'accesso del meccanismo di trascrizione al DNA5,6,7,8. In questo contesto, è essenziale capire quali siti CpG sono associati a tratti correlati all'obesità9. Molti fattori possono supportare o prevenire la metilazione del DNA sito-specifica. Gli enzimi necessari per questo processo, come le DNA metiltransferasi10 (DNTM) e le traslocazioni di dieci-undici (TET), possono promuovere la metilazione o la demetilazione del DNA in caso di esposizioni ^ambientali11.

Considerando il crescente interesse per gli studi di metilazione del DNA negli ultimi anni, la scelta della strategia di analisi più appropriata per rispondere con precisione a ciascuna domanda è stata una preoccupazione essenziale dei ricercatori12,13,14. L'array di metilazione del DNA 450K è il metodo più popolare, utilizzato in oltre 360 ^{pubblicazioni14} per determinare il profilo di metilazione del DNA. Può determinare la metilazione di un massimo di 485.000 CpG situati nel 99% dei geni ^noti15. Tuttavia, questo array è stato interrotto e sostituito con EPIC, coprendo 850.000 siti CpG. Il presente protocollo può essere applicato sia per 450K che per EPIC16,17,18.

Il protocollo è presentato passo dopo passo nella Figura 1 e comprende le seguenti fasi: selezione della popolazione, campionamento, preparazione dell'esperimento, pipeline di metilazione del DNA e analisi bioinformatica. Uno studio pilota eseguito nel nostro laboratorio è qui dimostrato per illustrare i passaggi del protocollo proposto.

Figura 1: Schema del protocollo presentato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Il comitato etico dell'Ospedale Universitario Ribeirão Preto Medical School dell'Università di San Paolo (HCRP-USP) ha approvato lo studio (CAAE:14275319.7.0000.5440). I partecipanti hanno firmato il modulo di consenso e tutte le procedure sono state condotte seguendo la Dichiarazione di Helsinki.

1. Popolazione e campionamento

1. Reclutare partecipanti con BMI >30 kg / ^m2 per lo studio. Per il presente studio, sono state reclutate 32 donne di una popolazione ^mista19 tra i 18 ei 60 anni.
   NOTA: Nell'HCRP-USP, sono stati osservati tassi più elevati di obesità principalmente nelle ^donne20. I partecipanti con obesità, con BMI ≥30 kg / ^m2 (n = 15), sono stati reclutati dalla clinica ambulatoriale metabolica di malattie in HCRP-USP. I partecipanti senza obesità, con BMI compreso tra 18,5 kg / ^m2 e 24,9 kg / ^m2 (n = 17), sono stati reclutati da altre cliniche e non avevano malattie gravi; i dati clinici sono riportati nella Tabella 1.
2. Escludere le donne incinte, le madri che allattano, i fumatori e consumano alcol.

2. Antropometria e composizione corporea

1. Misura il peso dei partecipanti utilizzando una scala antropometrica digitale da 200 kg. Assicurarsi di rimuovere le scarpe e gli indumenti in eccesso.
2. Valutare l'altezza utilizzando uno stadiometro con una graduazione di 0,5 cm. Ai partecipanti è stato chiesto di stare a piedi nudi, con i piedi uniti e le braccia ai ^lati21.
3. Raccogliere le informazioni sulla massa grassa (FM) utilizzando una bioimpedenza elettrica. Dopo 12 ore di digiuno, valutare con una vescica urinaria vuota. Posizionare i partecipanti in posizione supina, con le gambe divaricate e le braccia parallele senza toccare il corpo. Istruire i partecipanti a rimuovere tutti gli accessori ^metallici22.
4. Ottenere la circonferenza della vita (WC) utilizzando un nastro di misurazione inestensibile con una graduazione di 0,1 mm. Il nastro è stato posizionato orizzontalmente intorno alla vita centrale, appena sopra le ossa dell'anca. La misurazione è avvenuta subito dopo un espiro. Secondo i Centers for Diseases Control and Prevention (CDC), il cut-off del WC per le donne è di 88 ^cm23.

Tabella 1: Caratteristiche della popolazione. Tutte le variabili erano parametriche (p > 0,05, Shapiro Wilk) e le differenze sono state valutate utilizzando un t-test indipendente, in cui p < 0,05 è stato considerato significativo. *p < 0,0001. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

3. Raccolta di materiale biologico

1. Raccogliere il sangue periferico dopo 12 ore di digiuno, come descritto in ^precedenza24.
2. Raccogliere 4 ml di campioni di sangue intero in provette di raccolta con anticoagulante (ad esempio, EDTA) e conservarli sul ghiaccio per il trasporto.

4. Estrazione del DNA

1. Centrifugare ogni tubo contenente il sangue a 2.000 x g per 10 min. Raccogliere circa 300 μL del mantello buffy (interfase bianca).
2. Estrarre il DNA dal sangue periferico utilizzando uno strumento disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali), come descritto in precedenza25. Eluire il DNA in 480 μL di _H2O ultrapuro.
3. Valutare la concentrazione e la qualità del DNA utilizzando un fluorometro. L'integrità è stata valutata utilizzando un'analisi del gel di agarosio all'1%²⁵. Conservare in congelatore a -80 °C.

5. Preparazione prima dell'analisi di metilazione

1. Assicurarsi che i campioni abbiano la concentrazione minima di DNA (500 ng è l'input iniziale ideale per iniziare), ma la diluizione può variare tra i campioni in questo passaggio.
2. Alcuni reagenti non sono inclusi nel kit ^microarray26, quindi acquistali ^{separatamente27}.
3. Controllare se il kit contiene tutti i reagenti utilizzati durante la procedura; sono insostituibili. Controllare la data di scadenza di tutti i reagenti. Assicurarsi che siano disponibili anche altri reagenti e soluzioni non forniti nel kit (95% di formammide/1 mM EDTA, 0,1 N NaOH, etanolo assoluto, 2-propanolo).
   ATTENZIONE: La formamide è un reagente volatile; la qualità dei risultati può essere migliorata se il prodotto è fresco. L'integrità e la qualità della formammide e dell'etanolo assoluto sono considerate critiche perché possono influenzare il processo di colorazione proposto dal produttore. Gli alcoli scelti devono essere prodotti ultrapuri specifici per l'analisi di biologia molecolare.
4. Una volta acquisito il kit di microarray, scarica le Chips Decode Maps (DMAP). Tali file sono disponibili sul sito Web del produttore 24-48 ore dopo la spedizione del kit e sono esclusi alla data di ^scadenza28. Per scaricare i file menzionati, eseguire i passaggi seguenti.
   1. Assicurarsi che sia disponibile un computer con accesso a Internet. Eseguire il download utilizzando il software Decode File Client.
   2. Prima di installare il programma, assicurarsi che il computer abbia accesso in uscita e in entrata concesso dall'istituzione; Il client di decodifica file non dispone di restrizioni di sicurezza.
   3. Accedere al software Decode File Client utilizzando l'opzione Access by BeadChip. Questo accesso viene eseguito utilizzando l'ID utente e la password myIllumina. È richiesta la registrazione su questa ^pagina28.
   4. Dopo aver effettuato l'accesso al client Decode File, inserire le informazioni elencate di seguito nei rispettivi campi nella home page del ^software28: Elenco dei codici a barre; Elenco degli ID casella; Numero dell'ordine di acquisto (PO); e il numero dell'ordine di vendita (ricordarsi di non includere le lettere che seguono i numeri).
   5. Selezionare i DMAP da scaricare in base al numero di codice a barre nella casella di acquisto e specificare la destinazione nella finestra di dialogo per salvare i DMAP.
   6. Fare clic sul pulsante per avviare il download.
      NOTA: Al termine del download, assicurarsi che le cartelle scaricate non siano vuote e archiviare i file in modo sicuro, in quanto saranno necessari per il passaggio finale per convertire gli esperimenti in file di dati di intensità (file IDAT). Dopo la data di scadenza, Illumina può rimuovere i dati DMAP dal proprio database online.

6. Pipeline di metilazione del DNA

NOTA: L'esperimento di metilazione del DNA è diviso in 4 giorni (Figura 1). Seguire le raccomandazioni e le specifiche del produttore per ottenere risultati accurati.

1. Giorno 1: Trattamento bisolfito
   1. Inizia denaturando 500 ng di DNA genomico, quindi aggiungi i reagenti di conversione. Per eseguire questo passaggio, seguire le raccomandazioni dei kit bisolfito e ^microarray29.
   2. Trattare il DNA denaturato con 130 μL del reagente di conversione del bisolfito alla concentrazione standard fornita dal produttore.
   3. Incubare il tubo in un termociclatore per 16 cicli a 95 °C per 30 s e 50 °C per 1 ora. Scendere il termociclatore a 4 °C per 10 min.
   4. Eseguire la fase di lavaggio aggiungendo 100 μL del tampone di lavaggio e quindi centrifugando a piena velocità per 30 s. La concentrazione non è fornita nella guida per l'utente e il produttore standardizza i volumi.
      NOTA: questo reagente viene fornito con il kit e non ha bisogno di essere diluito o preparato.
2. Giorno 2: Amplificazione - Saggio di metilazione, Protocollo manuale
   1. Preriscaldare il forno di ibridazione a 37 °C e lasciare equilibrare la temperatura.
   2. Applicare un'etichetta con codice a barre su una micropiastra da 0,8 ml.
   3. Scongelare i reagenti di amplificazione (Multi-Sample Amplification Mix 1, Random Primer Mix e Multi-Sample Amp Master Mix) a temperatura ambiente (tali reagenti vengono forniti con il kit e non devono essere diluiti o preparati). Quindi, eseguire una delicata inversione almeno 10 volte fino a quando l'intero contenuto dei tubi non viene miscelato.
   4. Erogare 20 μL del Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) nei pozzetti della piastra.
   5. Trasferire 4 μL del campione di DNA dalla piastra convertita di bisolfito ai corrispondenti pozzetti sulla piastra da 0,8 mL. A questo punto, registrare l'ID del campione di DNA originale sul modulo di tracciamento di laboratorio corrispondente ai pozzetti della piastra.
   6. Erogare 4 μL di 0,1 N NaOH in ogni pozzetto della piastra contenente il Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) e il campione di DNA.
   7. Sigillare la piastra con un sigillo di plastica.
   8. Ruotare la piastra per miscelare i reagenti con i campioni a 1.600 giri /min per 1 min. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e rimuovere con cura il sigillo.
   9. Pipettare 68 μL di Random Primer Mix (RPM) in ogni pozzetto della piastra. Pipettare 75 μL di Multi-Sample Amp Master Mix (MSM) in ciascun pozzetto della piastra (senza rimuovere la soluzione precedente). Utilizzare un nuovo sigillo per coprire la piastra.
      NOTA: Fare attenzione ad abbinare i pozzetti con la piastra e orientarla correttamente.
   10. Vortice la piastra sigillata a 1.600 giri/min per 1 min. Incubare nel forno di ibridazione per 20-24 h a 37 °C.
3. Giorno 3: Ibridazione - Saggio di metilazione, protocollo manuale
   1. Preriscaldare il blocco a 37 °C.
   2. Scongelare il contenuto del tubo a temperatura ambiente. Invertire con attenzione e delicatezza i tubi FMS (Fragmentation Solution) almeno 10 volte per mescolare accuratamente il contenuto.
   3. Rimuovere con cura la piastra dal forno di ibridazione. Centrifuga a impulsi la piastra a 280 x g.
   4. Ora rimuovi il sigillo dalla piastra. In ogni pozzetto della piastra contenente un campione, aggiungere 50 μL di soluzione di frammentazione (FMS) e sigillare nuovamente la piastra. Vortice della piastra a 1.600 giri/min per 1 min.
   5. Centrifugare la piastra a 280 x g per alcuni secondi (eseguire la centrifugazione a impulsi). Quindi, posizionare la piastra sigillata sul blocco riscaldante a 37 °C per 1 ora.
   6. Se si decidesse di mettere in pausa l'esperimento e congelare la piastra, scongelarla a temperatura ambiente e centrifugarla a 280 x g. Se non è bloccato, saltare questo passaggio e passare al passaggio 6.3.7.
   7. Lasciare il blocco riscaldante preriscaldato a 37 °C.
   8. Lasciare scongelare il wash buffer a temperatura ambiente. Una volta scongelato, invertirlo almeno 10 volte per mescolare il contenuto.
   9. Rimuovere il sigillo dalla piastra.
   10. Aggiungere 100 μL di soluzione di precipitazione (PM1) a ciascun pozzetto della piastra contenente campioni.
   11. Sigillare nuovamente la piastra con il sigillo.
   12. Vortice della piastra a 1.600 giri/min per 1 min.
   13. Incubare a 37 °C per 5 min.
   14. Quindi, posizionare nella centrifuga a impulsi a 280 x g per 1 minuto.
       NOTA: Impostare la centrifuga a 4 °C per il passaggio successivo.
   15. Rimuovere con attenzione il sigillo dalla piastra e scartarlo.
   16. Aggiungere 300 μL di 2-propanolo (100%) a ciascun pozzetto contenente il campione.
   17. Sigillare la piastra con estrema cura utilizzando un nuovo sigillo. Fare attenzione a non scuotere il piatto.
   18. Invertire la piastra almeno 10x, mescolando l'intero contenuto.
   19. Incubare a 4 °C per 30 min.
   20. Centrifugare a 3.000 x g a 4 °C per 20 min.
       NOTA: Alla fine del passaggio 6.3.20, rimuovere immediatamente la piastra della centrifuga.
   21. Rimuovere il sigillo dalla piastra e scartarlo.
   22. Capovolgere rapidamente la piastra e scaricare il liquido su un tampone per scartare il surnatante. Quindi, colpire il piatto in un'area asciutta su un tovagliolo di carta per drenare il liquido.
   23. Toccare saldamente più volte per 1 minuto o fino a quando tutti i pozzetti sono privi di liquidi.
   24. Lasciare la piastra invertita e scoperta per 1 ora a temperatura ambiente.
       NOTA: Si prevede di vedere pellet blu sul fondo dei pozzi.
   25. Preriscaldare il forno di ibridazione a 48 °C.
   26. Accendere il blocco di calore per preriscaldare. Attendere 20 minuti per questo processo.
   27. Scongelare la risospensione, l'ibridazione e la soluzione di lavaggio a temperatura ambiente. Invertire almeno 10x. Controllare che non vi sia sale precipitato nella soluzione.
   28. Aggiungere 46 μL di soluzione di risospensione, ibridazione e lavaggio (RA1) a ciascun pozzetto della piastra.
       NOTA: Eventuali reagenti rimanenti devono essere riservati alle fasi di colorazione e ibridazione.
   29. Applicare il sigillo sulla piastra. Utilizzare un sigillo in alluminio per coprire la piastra. Tenere stretto per eseguire la sigillatura in modo uniforme.
   30. Controllare se tutti i pozzetti sono chiusi in modo sicuro per evitare l'evaporazione.
   31. Posizionare con cura la piastra appena sigillata nel forno di ibridazione e incubare a 48 °C per 1 ora.
   32. Vortice della piastra a 1.800 giri/min per 1 min.
   33. Centrifuga a impulsi a 280 x g.
   34. Trasferire la piastra nel blocco termico a 95 °C per 1 ora.
   35. Preparare le camere di ibridazione (Hyb) posizionandole insieme. Erogare 400 μL di tampone umidificante (PB2) nei serbatoi delle camere Hyb. Metti immediatamente il coperchio.
   36. Caricare ogni campione dalla piastra nell'apertura di ingresso del campione del microarray.
   37. Caricare gli inserti Hyb Chamber contenenti i microarray nella Hyb Chamber. Chiudere la camera Hyb trasversalmente per evitare possibili spostamenti della camera Hyb.
       NOTA: le camere Hyb devono essere incubate a 48 °C per almeno 16 ore, ma non più di 24 ore.
4. Giorno 4: Colorazione - Saggio di metilazione, Protocollo manuale
   1. Sospendere la soluzione colorante 4 con 330 mL di EtOH al 100%, ottenendo un volume finale di 350 mL. Agitare vigorosamente il flacone di soluzione colorante 4 per garantire la completa risospensione. Conservare a temperatura ambiente.
      NOTA: la soluzione colorante 4 può essere conservata per un massimo di 2 settimane a una temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C.
   2. Rimuovere le camere dal forno di ibridazione e lasciarle raffreddare sul banco per 30 minuti prima dell'apertura.
   3. Mentre la camera Hyb si sta raffreddando, riempire due contenitori di lavaggio con wash buffer (200 ml per contenitore di lavaggio). Ricordarsi di etichettare ogni contenitore come "Wash Buffer" (PB1 e PB2).
   4. Riempire gli accessori di allineamento del microarray con 150 ml di wash buffer.
   5. Separare i distanziali in plastica e, se necessario, pulire il vetro.
   6. Per lavare le diapositive del microarray, collegare l'anello del filo alla griglia e immergere l'attrezzatura gocciolante nei contenitori con 200 ml di wash buffer per un totale di 10x.
   7. Rimuovere tutti gli inserti dalla camera di ibridazione e rimuovere ogni matrice dagli inserti. Rimuovere il sigillo.
      NOTA: durante la rimozione, non toccare le matrici esposte.
   8. Durante la rimozione delle diapositive del microarray dalla camera di ibridazione, fare attenzione a non versare nulla.
   9. Lavare i microarray nella soluzione tampone di lavaggio (PB1) lentamente e leggermente, spostandosi su e giù di 10 volte. Passare a una soluzione PB1 fresca ed eseguire il lavaggio spostando lentamente i microarray 10 volte su e giù nella soluzione.
   10. Rimuovere il microarray dal contenitore e confermare l'assenza di residui.
   11. Utilizzare un distanziatore trasparente nella parte superiore di ciascun microarray e guidare i distanziatori nelle posizioni corrispondenti.
       NOTA: Fare attenzione a utilizzare solo i distanziali trasparenti, non quelli bianchi.
   12. Posizionate la barra di allineamento sull'accessorio di allineamento.
   13. Posizionare una piastra posteriore in vetro sulla parte superiore del distanziatore trasparente; fare attenzione a coprire l'intero microarray. Quindi, collegare morsetti metallici alle camere di flusso. Se necessario, utilizzare le forbici per tagliare le estremità dei distanziali della camera di flusso.
   14. Lavare immediatamente i serbatoi della camera di ibridazione utilizzando _ddH2O e strofinare con una piccola spazzola per la pulizia. Non lasciare che alcun tampone umidificante rimanga nel serbatoio.
   15. Passare al passaggio successivo responsabile dell'estensione e della colorazione del microarray.
       NOTA: Lasciare tutte le camere di flusso montate orizzontalmente sul banco di laboratorio. Rimergiali solo quando l'intera fase di colorazione è pronta. Riscaldare la soluzione di risospensione, ibridazione e lavaggio a una temperatura compresa tra 20 °C e 25 °C. Mescolare delicatamente fino a quando non si vede alcun cristallo nella soluzione.
   16. Posizionare i reagenti in un rack in sequenza. Se alcuni sono congelati, lasciarli a temperatura ambiente e quindi capovolgerli almeno 10 volte per mescolare le soluzioni.
   17. Riempire il circolatore d'acqua al livello appropriato.
   18. Accendere la pompa e impostare la temperatura a 44 °C.
   19. Rimuovere eventuali bolle attaccate al rack della camera.
   20. Eseguire test sul rack della camera utilizzando una sonda di temperatura. Tutti i luoghi testati devono essere compresi tra 44 °C ± 0,5 °C.
       NOTA: i seguenti passaggi devono essere eseguiti senza interruzioni.
   21. Quando il rack raggiunge una temperatura di 44 °C, posizionare rapidamente ogni gruppo nella camera di flusso.
       NOTA: per i passaggi seguenti, pipettare tutti i reagenti nella lastra di vetro posteriore.
   22. Pipetta 150 μL di soluzione di risospensione, ibridazione e lavaggio (RA1). Quindi, incubare per 30 minuti. Ripeti questo passaggio per un totale di 5 volte.
   23. Pipettare 450 μL di soluzione colorante 1 (XC1) e incubare per 10 min.
   24. Pipettare 450 μL di Soluzione Colorante 2 (XC2) e incubare per 10 min.
   25. Pipetta 200 μL di Two-Color Extension Master Mix (TEM) e incubare per 15 min.
   26. Pipettare 450 μL di 95% di formammide/1 mM EDTA e incubare per 1 min. Ripetere due volte.
   27. Incubare per 5 min.
   28. Ridurre la temperatura del rack della camera a 32 °C (indicato su Superior Two-Color Master Mix).
   29. Pipettare 450 μL di Stain Solution 3 (XC3) e incubare per 1 min. Ripetere 1x.
   30. Attendere che il rack nella camera raggiunga la temperatura corretta.
       NOTA: per leggere l'immagine del microarray immediatamente dopo il processo di colorazione, accendere lo scanner in questa fase.
   31. Ora eroga 250 μL di Superior Two-Color Master Mix (STM), seguito da un'incubazione di 10 minuti.
   32. Quindi, erogare 450 μL di Stain Solution 3 (XC3), seguito da 1 min di incubazione. Ripeti 1x.
   33. Attendere 5 minuti e poi aggiungere 250 μL di Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) e incubare per 10 min.
   34. Ora eroga 250 μL di Superior Two-Color Master Mix (STM), seguito da un'incubazione di 10 minuti.
   35. Quindi, erogare 450 μL di Stain Solution 3 (XC3), seguito da 1 min di incubazione. Ripeti 1x.
   36. Attendere 5 minuti.
   37. Aggiungere 250 μL di Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) e incubare per 10 min.
   38. Aggiungere 450 μL di Stain Microarray Solution 3 (XC3) e incubare per 1 minuto, quindi ripetere di nuovo.
   39. Attendere 5 minuti.
       NOTA: eseguire il seguente schema di ripetizione: Passaggio 6.4.34., Passaggio 6.4.35. e passo 6.4.36.; Passaggi 6.4.37., 6.4.38. e Passaggio 6.4.39.; Passaggio 6.4.34., Passaggio 6.4.35 e Passaggio 6.4.36.
   40. Ora, rimuovere immediatamente le camere di flusso dal rack e posizionarle con cura orizzontalmente sul banco di laboratorio. Assicurarsi che la temperatura sia ambiente.
   41. 6.4.41.Posizionare 310 mL di soluzione di lavaggio (PB1) per ciascun microarray in un contenitore di lavaggio.
   42. Rimuovere i morsetti metallici e il vetro e, infine, il microarray.
   43. Posizionare i microarray su una griglia di colorazione e metterli nel contenitore di lavaggio contenente 10x PB1 soluzione. Assicurati che i codici a barre siano rivolti lontano da chi li sta maneggiando e che tutti i microarray siano sommersi.
   44. Muoviti lentamente e leggermente con movimenti su e giù 10x. Il microarray deve essere rimosso completamente dalla soluzione prima di essere nuovamente immerso. Quindi, lascia che rimanga sommerso per 5 minuti.
   45. Agitare vigorosamente il reagente Stain Solution 4 (XC4) per garantire la risospensione totale. Posizionare 310 ml di XC4 in un contenitore di lavaggio.
       NOTA: Non lasciare riposare la soluzione nel contenitore di lavaggio per più di 10 minuti.
   46. Spostare leggermente il supporto di colorazione sull'altro contenitore con XC4.
   47. Muoviti lentamente e leggermente con movimenti su e giù 10x. Assicurarsi che il microarray venga rimosso completamente dalla soluzione prima di essere nuovamente immerso.
   48. Quindi, lasciare che il microarray rimanga sommerso per 5 minuti.
   49. Spostare il supporto di colorazione fuori dalla soluzione e posizionarlo in un supporto per tubi con i codici a barre rivolti verso l'alto.
   50. Rimuovere con cura il microarray usando una pinza di bloccaggio e posizionarli su uno scaffale per asciugarli.
   51. Asciugarli utilizzando l'essiccatore sottovuoto per 50-55 minuti a 675 mm Hg (0,9 bar).
   52. Pulire il retro di ogni microarray utilizzando EtOH.
       ATTENZIONE: Evitare di toccare le strisce e non permettere a EtOH di gocciolare sulle strisce in alcun modo.
   53. Procedere all'immagine del microarray.
   54. Conservare con cura il microarray in una scatola di stoccaggio a temperatura ambiente.
       NOTA: le immagini microarray devono essere scattate entro 72 ore.

7. Analisi bioinformatica

NOTA: è necessario modificare alcuni attributi del tipo di microarray (ad esempio, arraytype = "450k" deve essere sostituito da arraytype = "EPIC"). L'autore della pipeline ChAMP descrive in dettaglio tutti i campi che devono essere modificati per analizzare gli array nella pagina Bioconductor del ^package30.

1. Foglio campione
   1. Trasferire i file IDAT al computer per procedere con l'analisi ^{bioinformatica31}. Creare un foglio di esempio per eseguire l'analisi dei ^dati31.
      NOTA: tre colonne sono essenziali per questo file di foglio di calcolo. Il primo è Sample_name. Questa colonna deve includere i nomi o i codici utilizzati per identificare i campioni. Il secondo è il Sentrix_position. Questa colonna posiziona l'R01C01 corrispondente dei campioni, con R01 responsabile della riga del chip e la colonna denominata C01. La terza colonna essenziale è la Sentrix_ID ed è responsabile della ricezione del numero che identifica il microarray. Assicurati di inserire i numeri corretti. È possibile aggiungere altre informazioni sul foglio campione come valori variabili. Nel presente esperimento sono stati inclusi i dati dell'analisi dei metalli.
2. Pipeline ChAMP
   1. Installare RStudio (V.4.0.2) nel computer per eseguire ^l'analisi30.
      NOTA: assicurarsi che il computer disponga di almeno 8 G di RAM. L'analisi dei dati avrà difficoltà o si bloccherà con una quantità inferiore di RAM.
   2. Dopo l'installazione, aprire RStudio e installare il pacchetto ChAMP ^{Bioconductor30} utilizzando la rispettiva riga di comando (vedere Materiale supplementare 1).
      NOTA: se si verifica un errore al termine dell'installazione, installare manualmente le librerie ChAMP richieste, una per ^una26.
   3. Ora importa i dati grezzi ed esegui l'analisi. Vedere il materiale supplementare 1.
      champ.load() importa i dati grezzi ed esegue il processo di filtraggio, escludendo le sonde con pval a basso rilevamento, i siti multihit, le sonde non CG, i siti CpG vicino agli SNP e i CpG situati nei cromosomi sessuali.
      champ.impute() esegue l'imputazione KNN come impostazione predefinita.
      masticare. QC recupera i grafici della qualità dei dati (ad esempio, il grafico del grafico della densità).
      masticare. SVD valuta gli effetti batch in base ai metadati forniti nel foglio di esempio.
      champ.refbase() esegue la stima e la correzione del tipo di cella.
      masticare. DMP( ) recupera posizioni differenzialmente metilate e associazioni di tratti come la massa grassa per controllare la metilazione del DNA tra i gruppi e modificare i parametri, come mostrato nel Materiale supplementare 1.
3. Arricchimento (STRING DB)
   NOTA: L'arricchimento funzionale viene utilizzato per dedurre le funzioni biologiche di un insieme di geni.
   1. Per arricchire i dati in una stringa, selezionare l'elenco delle destinazioni da arricchire e utilizzare come input da: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
   2. Per l'organismo, selezionare l'homo sapiens e premere il pulsante Cerca.
   3. Per navigare attraverso l'arricchimento, fare clic sul pulsante Analisi.
4. Invio GEO
   1. Deposita i dati in un repository pubblico come GEO di NCBI. Per questo, registrati per l'account mittente.
      NOTA: completare l'invio GEO (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) scaricando il foglio di metadati con informazioni descrittive e protocolli per l'esperimento complessivo e singoli campioni. Gli invii di archivi GEO possono essere creati in qualsiasi software per fogli di calcolo. In secondo luogo, aggiungere il file di dati non elaborati generato dallo script di conteggio dei ranger di celle per tutte le librerie nella directory. IDAT e file associati o un foglio di lavoro a matrice contiene dati non normalizzati. La terza cartella sono i file di dati elaborati. La tabella a matrice è un foglio di calcolo contenente i valori finali normalizzati comparabili tra righe e campioni e preferibilmente elaborati come descritto in qualsiasi manoscritto di accompagnamento.
   2. Inserire nella directory i file di dati elaborati generati dallo script di conteggio dei ranger di celle per tutte le librerie. Utilizzare le credenziali del server FTP del mittente GEO per trasferire la directory contenente tutti e tre i componenti.

Risultati

Dopo aver utilizzato la pipeline ChAMP, nell'analisi sono state prese in considerazione 409.887 sonde dopo tutti i filtri (CpG non qualificati, sonde non CG, CpG vicino a SNP, siti multihit e CpG relativi a XY); uno schema è rappresentato nella Figura 2.

Figura 2: Pipeline dell'analisi bioinformatica. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Inoltre, il grafico della densità ha rivelato che tutti i campioni avevano densità simili della distribuzione beta relative alle fasi di controllo della qualità. Questa analisi valuta la distribuzione dei valori beta e indica se ci sono campioni che devono essere esclusi. In questo lotto, nessun campione è stato escluso sulla base di questa analisi.

Figura 3: Grafico della densità dei valori beta ottenuto con il pacchetto ChAMP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'analisi della decomposizione a valore singolare (SVD) è stata utilizzata per verificare i componenti principali che hanno influenzato in modo significativo la variabilità dei dati di metilazione del DNA. I dati hanno rivelato che BMI, WC (p < 1e10-5) e FM (p < 0,05) hanno avuto un effetto significativo sulla variabilità dei dati (Figura 4).

Figura 4: Analisi della decomposizione del valore singolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La stima del tipo di cellula ha rivelato che sia le cellule natural killer (NK) che le cellule B erano più alte nelle donne obese (Figura 5).

Figura 5: Frazioni cellulari stimate con il metodo di Houseman. Gran: granulocita. CD4T: cellule T helper, linfociti. CD8T: cellule T citotossiche, linfociti. Mono: monocita. Cellula B: linfocita B. NK: cellule natural killer, linfociti. *p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I livelli di metilazione del DNA tra donne obese e non obese differivano prima e dopo la correzione del tipo di cellula. Prima della correzione dei dati di metilazione del DNA per i tipi di cellule, sono state osservate 43.463 posizioni differenzialmente metilate (DMP) e 3.329 CpG sono rimasti significativi dopo. 445 siti CpG erano in regioni intergeniche (IGR) e 2.884 erano in regioni geniche, con la maggior parte nella regione promotore (n = 1.438). La distribuzione lungo tutte le regioni era TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5'UTR (n = 390), primo esone (n = 273), corpo (n = 724) e 3'UTR (n = 59). Considerando i valori di Δβ <-0,05 e >0,05, 162 CpG erano ipometilati e 576 erano ipermetilati negli obesi rispetto agli individui non obesi (Figura 6). I dati sono disponibili nella banca dati GEO con il codice registro GSE166611.

Figura 6: Posizioni differenzialmente metilate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

È possibile valutare la diversa metilazione tra i gruppi e trovare siti CpG associati a tratti specifici negli studi di metilazione. Per gli studi sulla massa grassa, sono stati trovati 13.222 siti CpG. 6.159 CpG nella regione del promotore erano correlati alla massa grassa, con 470 ipermetilati e 94 ipometilati (Figura 7), e i rispettivi geni sono stati arricchiti (Tabella 2).

Figura 7: Regioni promotrici di geni ipometilati e ipermetilati, indipendentemente correlati alla massa grassa. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Tabella 2: Arricchimento funzionale dei geni dai siti CpG differenzialmente metilati. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Materiale supplementare 1: Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Gli array di metilazione del DNA sono i metodi più utilizzati per accedere alla metilazione del DNA grazie al loro rapporto ^{costi-benefici14}. Il presente studio ha descritto un protocollo dettagliato che utilizza una piattaforma di microarray disponibile in commercio per valutare la metilazione del DNA in uno studio pilota eseguito in una coorte brasiliana. I risultati ottenuti dallo studio pilota hanno confermato l'efficacia del protocollo. La figura 3 mostra la comparabilità del campione e la conversione completa del bisolfito32.

Come fase di controllo qualità, l'algoritmo ChAMP ha raccomandato l'esclusione dei siti CpG durante il processo di filtraggio. L'obiettivo di escludere le sonde è migliorare l'analisi dei dati ed eliminare i pregiudizi. I CpG di bassa qualità (valori p inferiori a 0,05) sono stati rimossi per eliminare il rumore sperimentale nel set di dati. Gli obiettivi sono rimasti superati nell'analisi del grafico di densità. ^Zhou33 ha descritto l'importanza di filtrare i CpG vicino agli SNP per evitare discrepanze, interpretazioni errate della metilazione delle citosine polimorfiche e causare il colore dell'interruttore del design della sonda di tipo ^I34. Inoltre, poiché i cromosomi XY sono influenzati in modo differenziale dall'imprinting, Heiss e ^Just35 hanno rafforzato l'importanza di filtrare tali sonde perché, nelle femmine, i problemi con l'ibridazione possono essere fattori ^{confondenti35}.

La data di scadenza dei DMAP, la data di apertura della formammide, la qualità analitica dell'etanolo assoluto e la conta totale dei leucociti sono considerate fasi critiche nel protocollo.

Inoltre, secondo le nostre osservazioni, la stima del tipo di cellula è essenziale per eseguire l'analisi bioinformatica. Il metodo Houseman esegue la stima del tipo di cellula come descritto nello studio di ^Tian30. Questo metodo si basa su 473 siti CpG specifici in grado di prevedere le percentuali dei tipi di cellule più importanti, come granulociti, monociti, cellule B e cellule ^T36. Abbiamo usato la funzione consigliata "myRefbase" dal pacchetto ChAMP. Dopo la stima, l'algoritmo ChAMP regola i valori beta ed elimina questa distorsione dal set di dati. Questo passaggio è cruciale negli studi incentrati sull'obesità perché questa popolazione ha una notevole differenza nei globuli bianchi a causa del loro stato infiammatorio cronico.

Abbiamo solo modificato la mappa del cappuccio originale per il sigillo PCR comune per quanto riguarda la modifica del metodo e la risoluzione dei problemi. Dopo ogni processo di centrifugazione, il sigillo è stato cambiato con uno nuovo. Non abbiamo potuto utilizzare la termosaldatura standard e l'abbiamo adattata usando un foglio di alluminio attorno alla piastra.

Sebbene i saggi commerciali siano stati considerati un gold standard per gli studi epigenetici, una limitazione del protocollo potrebbe essere la specificità dei reagenti e delle apparecchiature di un marchio unico37,38,39,40. Un'altra limitazione è la mancanza di indicatori che consentano di identificare il corretto svolgimento dell'esperimento41.

La standardizzazione del presente protocollo rappresenta un'ottima guida per la ricerca epigenetica, riducendo gli errori umani durante il processo e consentendo un'analisi dei dati di successo e la comparabilità tra diversi studi.

Secondo i nostri risultati, gli esperimenti di metilazione del DNA sono adatti per studi che confrontano individui con e senza ^obesità43. Inoltre, l'analisi bioinformatica proposta ha fornito dati di alta qualità e potrebbe essere presa in considerazione in studi su larga scala.

Utilizzando l'analisi SVD, abbiamo identificato che i tratti correlati all'obesità (BMI, WC e FM) hanno influenzato la variabilità nei dati di metilazione del DNA. Come risultato significativo, la stima del tipo di cellula indica che sia le cellule natural killer (NK) che le cellule B erano più alte nelle donne con obesità rispetto alle donne senza obesità (Figura 5). I conteggi più elevati di queste cellule potrebbero essere spiegati dallo stato infiammatorio di basso grado di questi ^individui44. Abbiamo osservato che i pazienti con obesità hanno CpG ipo- e ipermetilati nelle regioni promotrici dei geni associati alla massa grassa. La maggior parte dei siti erano ipometilati, il che potrebbe essere correlato al naturale aumento dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in questi individui. Questa condizione di stress ossidativo può promuovere la perturbance della guanina nel sito di dinucleotide, formando 8-idrossi-2'-deossiguanosina (8-OHdG), con conseguente sito dinucleotide 5mCp-8-OHdG e causando il reclutamento degli enzimi TET. Tutti questi eventi potrebbero essere responsabili della promozione dell'ipometilazione e dell'ipermetilazione del DNA da parte di diversi meccanismi ^d'azione45.

Inoltre, il tasso di adipogenesi sembra aumentare negli individui con obesità, con circa il 10% di cellule nuove a cellule ^vecchie46,47. I contributi epigenetici, enfatizzando l'ambiente obesogenico, possono alterare i tassi di proliferazione e differenziazione delle cellule, favorendo lo sviluppo della massa ^grassa48. I cambiamenti epigenetici possono anche influenzare i programmi adipogenici, facilitando o limitando il loro sviluppo. I fattori di trascrizione primaria (PPARγ o C / EBPα) o l'assemblaggio di complessi multiproteici, posizionati in regioni promotori a valle operate includendo o escludendo enzimi modificanti epigenetici, regolano l'espressione genica attraverso iper- o ipometilazione45. La via PPARγ è stata precedentemente descritta per alterare la via WNT, che aveva geni arricchiti in questo studio. Sebbene non sia ancora noto come si verifichi la segnalazione WNT durante l'adipogenesi, studi recenti hanno riportato che potrebbe avere ruoli essenziali nel metabolismo degli adipociti, in particolare in condizioni obesogene49.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etanolo assoluto	J.T. Baker	B5924-03
Gel di agarosio	Kasvi	K9-9100
Bioimpedenza elettrica	Quantum BIA 450 Q - Sistema
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Corning	46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold kit	ZymoResearch, Irvine, CA, USA	D5001
Formamide	Sigma	F9037
FMS— Soluzione di frammentazione	Illumina	11203428	Reagenti forniti
HumanMethylation450 BeadChip	Illumina
Maxwell Instrument	Promega, Brasile	AS4500
MA1— Amplificazione multi-campione 1 Mix	Illumina	11202880	Reagenti in dotazione
MicroAmp Pellicola adesiva ottica	Thermo Fisher Scientific	201703982
MSM— Master Mix di amplificazione multi-campione	Illumina	11203410	Reagenti in dotazione
NaOH	F. MAIA	114700
PB1— Reagente utilizzato per preparare i BeadChips per l'ibridazione	Illumina	11291245	Reagenti in dotazione
PB2... Tampone umidificante utilizzato durante l'ibridazione	Illumina	11191130	Reagenti in dotazione
2-propanolo	Emsure	10,96,34,01,000
RA1— Soluzione di risospensione, ibridazione e lavaggio	Illumina	11292441	Reagenti in dotazione
RPM— Miscela di primer casuale Illumina		15010230	reagenti in dotazione
STM— Master Mix Superiore a Due Colori	Illumina	11288046	Reagenti in dotazione
TEM— Estensione a due colori Master Mix	Illumina	11208309	Reagenti in dotazione
EDTA ultrapuro	Invitrogen	155576-028
Piastra di reazione a 96 pozzetti con codice a barre (0,1 ml)	ByoSystems	4346906
Piastra di reazione a 96 pozzetti con codice a barre (0,8 ml)	Thermo Fisher Scientific	AB-0859
XC1... XStain BeadChip soluzione 1	Illumina	11208288	Reagenti in dotazione
XC2— XStain BeadChip solution 2	Illumina	11208296	Reagenti in dotazione
XC3— XStain BeadChip solution 3	Illumina	11208392	Reagenti in dotazione
XC4— XStain BeadChip solution 4	Illumina	11208430	Reagenti in dotazione