Espansione e arricchimento di cellule T Gamma-Delta (γδ) da prodotto umano afereso

La recidiva di leucemia è la principale causa di mortalità dopo trapianto di cellule ematopoietiche (HCT) in pazienti con LMA1,2,3. Una migliore sopravvivenza libera da leucemia è stata riportata con l'aumento del recupero delle cellule T γδ nel sangue dopo HCT senza aumento del rischio di graft-versus-host disease (GVHD)⁴. La capacità delle cellule T γδ di riconoscere gli antigeni in modo indipendente dall'MHC e di sviluppare forti funzioni effettrici citolitiche e simili a Th1 rendono questa sottopopolazione minore di cellule T ideale per il trattamento dei pazienti affetti da LMA sottoposti a trapianto allogenico a rischio di ^recidiva5. Dato che le cellule T Vγ9Vδ2 sono un sottoinsieme minore di linfociti T che vanno dallo 0,5% al 5% delle cellule T nella ^periferia6, abbiamo deciso di stabilire un sistema robusto per espandere questa rara popolazione di cellule del sangue per ottenere dosi potenzialmente terapeutiche per studi clinici.

Sebbene altri abbiano espanso con successo le cellule T γδ usando acido zoledronico e persino aAPC, abbiamo sviluppato un processo che può potenzialmente espandere le cellule T γδ di 229.749 volte. L'espansione è bifasica: in primo luogo, i linfociti sono ottenuti per elutrazione utilizzando lo strumento di separazione. L'apparecchiatura fornisce un sistema chiuso che consente la separazione delle celle in base alle loro dimensioni, forma e densità mediante centrifugazione controcorrente. Dopo l'arricchimento per i linfociti, l'espansione selettiva delle cellule T Vγ9Vδ2 si ottiene mediante trattamento con acido zoledronico e IL-2 per 7 giorni. Immediatamente dopo questo trattamento, le cellule T TCR-αβ vengono esaurite utilizzando la tecnologia delle microsfere, consentendo la successiva espansione delle cellule T γδ con aAPC derivate da K562.

Per la validazione del processo, solo 5 × 106 cellule T γδ espanse con acido zoledronico sono state utilizzate solo 5 × ¹⁰⁶ cellule T γδ espanse con aAPC. In questa seconda fase di espansione, le cellule T γδ vengono attivate utilizzando una banca di cellule di lavoro (WCB) conforme alle good manufacturing practices (cGMP) di aAPC derivate da K562 geneticamente modificate (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL; scFv-CD28-IL15-RA)) prodotte a Moffitt. Il razionale di questa espansione bifasica si basa sulla capacità dell'acido zoledronico di inibire la farnesil difosfato sintasi (FDPS) nei monociti, portando all'accumulo di isopentenil pirofosfato, che stimola direttamente le cellule Vγ2Vδ2. Nella seconda fase di espansione, le aAPC derivate da K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) forniscono una robusta stimolazione a tutte le cellule T. Tuttavia, il prodotto cellulare è già stato arricchito per le cellule T γδ, con conseguente robusta espansione delle cellule T γδ.

Con l'uso di attrezzature e palloni specifici, il processo è un sistema funzionalmente chiuso, diminuendo così il rischio di contaminazione. Inoltre, il bioreattore a sistema chiuso da 1 L facilita la massima crescita ed espansione delle cellule in un volume totale di 1 L di mezzo con un minimo bisogno di alimentazione. Il vantaggio del metodo Moffitt è che fornisce un sistema GMP rapido, riproducibile e altamente fattibile per produrre un prodotto a base di cellule T γδ altamente puro, derivato da donatori, per la somministrazione allogenica. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi studio clinico che mira a utilizzare cellule T γδ umane che esprimono recettori delle cellule T Vγ2Vδ2 come immunoterapia adottiva per mediare l'immunità contro microbi e tumori in pazienti oncologici con remissione parziale e completa. Inoltre, fornisce una solida piattaforma per lo sviluppo e la produzione di cellule T positive al recettore dell'antigene γδ chimerico (CAR⁺).

NOTA: è stata ottenuta l'approvazione dell'IRB e il consenso informato è stato ottenuto dai donatori.

1. Isolamento dei linfociti

1. Trasferire il prodotto di aferesi in una camera bianca.
   NOTA: la convalida del processo è stata eseguita utilizzando la normale aferesi del donatore da un fornitore commerciale esterno conforme alle normative sulla raccolta delle materie prime cellulari.
2. Raccogliere campioni per test di sterilità, conteggio cellulare e fenotipizzazione cellulare.
3. Elutriato sul dispositivo di centrifugazione controcorrente utilizzando un mezzo primario di Hanks Balanced Salt Solution con albumina sierica umana all'1% (HSA) e un mezzo secondario di soluzione salina (0,9% di cloruro di sodio injection USP) o soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Impostare la velocità di centrifugazione di elutrazione a 900 × g e raccogliere frazioni in base alla portata e al tempo.
4. Raccogliere campioni dalla frazione 2 ed eseguire i seguenti test: 2 ml per test di sterilità; 0,5 mL per la conta cellulare e la vitalità con acridina arancio/ioduro di propidio (AO/PI); 5 × ¹⁰⁶ cellule per la fenotipizzazione cellulare mediante citometria a flusso.
5. Espandere una frazione linfocitaria pura (frazione 2) di cellule in coltura a 10 × ¹⁰⁶ cellule/^cm2 in un bioreattore a sistema chiuso da 1 L con 5 μmol/L di acido zoledronico e 300 UI/mL di IL-2.
6. Incubare per sette giorni in un incubatore impostato a 37 °C con il 5% di _CO2.

2. Deplezione delle cellule T alfa-beta (αβ)

1. Raccogliere le cellule dal pallone del bioreattore a sistema chiuso da 1 L. Saldare sterili un pacco di trasferimento da 1 L alla linea rossa del bioreattore a sistema chiuso e utilizzare la pompa farmaceutica appropriata per trasferire le cellule nel pacchetto di trasferimento.
2. Prelevare i seguenti campioni: 10 ml per sterilità media esaurita; 0,5 mL di cellule per la conta e la vitalità delle cellule utilizzando AO/PI; 5 × ¹⁰⁶ cellule per citometria a flusso
3. Risospese le cellule a ~ 5 × ¹⁰⁸ cellule / mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o (PBS / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)) tampone + 0,5% HSA e anticorpo biotinilato TCR αβ-specifico.
4. Mettere lo shaker in frigorifero e incubare le cellule a 2-8 °C per circa 15 minuti con agitazione.
5. Lavare le celle con un totale di 600 ml di tampone PBS/EDTA + 0,5% HSA. Centrifugare per rimuovere l'anticorpo non legato a 200-500 × g per 15 minuti a 2-8 °C. Risospeso ~ 5 × ¹⁰⁸ cellule / mL in tampone PBS / EDTA + 0,5% HSA con microsfere anti-biotina-specifiche (7,5 mL / 1 fiala).
6. Mettere lo shaker in frigorifero e incubare le cellule a 2-8 °C per circa 15 minuti con agitazione. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 200-500 × g per 15 minuti a 2-8 °C per rimuovere le microsfere non legate. Sospendere ~ 6 × ¹⁰⁷ celle / mL nel tampone PBS / EDTA + 0,5% HSA e trasferirle in un sacchetto di trasferimento.
7. Installare il set di tubi nel dispositivo di separazione delle celle magnetiche di grado clinico seguendo le istruzioni del produttore, posizionare le confezioni con il tampone PBS/EDTA e la confezione di trasferimento con il prodotto cellulare nello strumento e puntarlo quando indicato dallo strumento.
8. Selezionare il protocollo Depletion 1.2 per l'esaurimento delle cellule T αβ etichettate.
9. Centrifugare la frazione bersaglio (cellule T γδ arricchite) e risospescere le cellule in mezzo integrato con il 10% di siero AB umano.
10. Prelevare un campione da 0,5 ml ed eseguire un conteggio delle cellule e la vitalità con la colorazione AO/PI. Portare le cellule ad una concentrazione finale di circa 1 × ¹⁰⁶ cellule/ml. Prelevare un campione di 5 × ¹⁰⁶ cellule del prodotto per la fenotipizzazione della citometria a flusso post-esaurimento.

3. Co-cultura con aAPC

1. Irradiare 5 × ¹⁰⁷ aAPC/pallone a 100 Gy sullo strumento di generazione di raggi X.
2. Utilizzare le aAPC in co-coltura con un rapporto 10:1 con le cellule T γδ. Porre le cellule AAPC irradiate (5 × ¹⁰⁷ cellule/pallone) e le cellule T γδ (5 × ¹⁰⁶ cellule/pallone) in palloni bioreattori a sistema chiuso da 1 L con 1 L di terreno di coltura integrato con siero AB umano al 10%. Semina fino a 10 boccette.
3. Espandere le cellule in coltura per 10 giorni in un incubatore a 37 °C e 5% di _CO2.
4. Monitorare i livelli di glucosio e lattato ogni 3-4 giorni utilizzando strisce, glucosio e un misuratore di lattato.
5. Se il glucosio scende a 250 mg/dL, ridurre il volume nel matraccio a 200 ml utilizzando una pompa farmaceutica saldando a sterili una confezione di trasferimento da 1 L sulla linea rossa del bioreattore a sistema chiuso.
6. Mescolare le cellule nei restanti 200 ml e prelevare un campione da 0,5 ml per il conteggio delle cellule e la misurazione della vitalità mediante colorazione AO-PI. Se il numero di cellule è ≥¹⁰⁹, dividere un matraccio in due palloni e riempire ciascun matraccio fino a 1 L con AIM-V integrato con siero AB umano al 10%. Se il numero di cellule è <¹⁰⁹, nutrire le cellule con un litro fresco di terreno di coltura integrato con il 10% di siero AB umano.
7. Ripetere il passaggio 3.6 per tutti i palloni e restituirli all'incubatore a 37 °C e al 5% di _CO2. Ripetere i passaggi 3.4-3.7 ogni 3 o 4 giorni.

4. Raccolta delle cellule

1. Alla fine di 10 giorni in co-coltura, raccogliere tutte le fiasche del bioreattore. Raccogliere 1 pallone bioreattore alla volta e raggruppare tutte le cellule in un pacchetto di trasferimento di dimensioni appropriate. Saldare sterilemente il pacchetto di trasferimento alla linea rossa del bioreattore a sistema chiuso e utilizzare la pompa farmaceutica per trasferire le cellule nel pacchetto di trasferimento.
2. Rimuovere i seguenti campioni di controllo qualità: 1% del prodotto farmaceutico (DP) per la sterilità mediante emocoltura e colorazione del grammo; 0,5 mL per il conteggio e la vitalità delle cellule utilizzando AO/PI; 5-10 × ¹⁰⁶ cellule per la citometria a flusso (vedi Figura 1 per la strategia di gating); 0,5 ml per endotossina; 0,5 ml per la colorazione dei grammi; ¹⁰⁶ cellule sono entrate in 10 ml di terreno esaurito per il test del micoplasma.
3. Centrifugare le celle a 200-500 × g per 15 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
4. Lavare le celle in una soluzione di soluzione cristallina bilanciata + 0,5% HSA a 200-500 × g per 15 minuti a temperatura ambiente. Risospenderli in un volume target di 100-300 ml di soluzione cristallina bilanciata + 0,5% HSA.

5. Test di rilascio

1. Eseguire test di controllo qualità della cellula T γδ DP per quanto segue: purezza e identità mediante citometria a flusso (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); vitalità mediante colorazione AO/PI; endotossina; Test del micoplasma mediante reazione a catena della polimerasi (PCR); sterilità mediante colorazione al grammo e emocoltura aerobica e anaerobica; saggio K562 residuo mediante citometria a flusso (CD3-CD16-CD56-CD71⁺).

Il processo delle cellule T γδ è stato caratterizzato e ottimizzato per la produzione del prodotto farmaceutico a cellule T γδ. L'ottimizzazione del processo ha incluso 1) arricchimento dei linfociti mediante elutriazione, 2) espansione specifica delle cellule T (DS) della sostanza farmaceutica delle cellule T γδ con acido zoledronico, 3) deplezione delle cellule T γδ DS di TCRαβ, 4) espansione secondaria della cellula T γδ DS utilizzando aAPC derivate da K562 e 5) raccolta DP finale e formulazione del prodotto per somministrazione o crioconservazione. Dopo l'ottimizzazione del processo, le prove di conferma sono state eseguite su larga scala utilizzando il materiale derivato da tre donatori sani per confermare l'idoneità all'elaborazione cellulare. Tutti i dati sono stati analizzati e sono riassunti nella Tabella 1, tabella 2 e tabella 3. Le cellule separate dalla frazione di centrifugazione post-controflusso 2 (F2) hanno prodotto una popolazione di linfociti puri con una media del 99,23% di cellule CD45+ (riportata come frequenza del gate vivo totale) e un'eccellente vitalità media del 95,80% (Tabella 1).

L'espansione specifica delle cellule T γδ con acido zoledronico dipendeva dalla percentuale iniziale di cellule natural killer (NK) presenti nella frazione linfocitaria (F2) dopo l'elutrazione. L'arricchimento della cellula T γδ DS con la deplezione di TCRαβ è stato coerente (Tabella 2). Le cellule T γδ DP prodotte da tre donatori sani avevano una media dello 0,11% ± 0,05% di cellule CD20+ B e dello 0,00% ± 0,00% di cellule TCR αβ+, soddisfacendo così il criterio di rilascio di ≤1% delle cellule T TCR αβ+. La percentuale media di celle NK nel prodotto finale è del 17,06% ± del 26,19% e soddisfa il criterio di rilascio del <35%. Inoltre, la percentuale media di cellule T e cellule NK negative al lignaggio nel prodotto finale è stata dello 0,48% ± dello 0,42% (Tabella 3). La colorazione della superficie cellulare e l'analisi citometrica a flusso sono state utilizzate per caratterizzare l'identità, la purezza e le impurità di processo del DS e del DP, come mostrato nella Figura 2A-D.

L'espansione secondaria, ottenuta dalla co-coltura delle cellule T AAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB e γδ T cell DS con un rapporto di 10:1, ha generato un DP della cellula T γδ che soddisfaceva tutti i criteri di rilascio, come mostrato nella Tabella 4. Inoltre, le cellule sono state colorate e valutate mediante citometria a flusso alle cellule F2 di centrifugazione controcorrente del giorno 0, cellule T espanse dell'acido zoledronico del giorno 7, deplezione delle cellule T del giorno 7-TCR αβ, DP del giorno 17-finale per i seguenti biomarcatori cluster di differenziazione (CD)3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, recettore delle chemochine CC 7 (CCR7), proteina di morte cellulare programmata-1 (PD-1), la proteina 4 associata ai linfociti T citotossici (CTLA4), il gene 3 attivante i linfociti (LAG3) e l'immunoglobulina delle cellule T e la proteina 3 contenente il dominio della mucina (TIM3). I dati mostrati nella Figura 3 sono mediati da tre cicli indipendenti e dimostrano che le cellule non hanno raggiunto l'esaurimento. Il CTF Moffitt ha anche sviluppato un test K562 residuo per determinare le impurità DP correlate alle aAPC derivate da K562 (Figura 4).

La strategia di gating citometrico a flusso utilizzata per caratterizzare le percentuali dei tipi cellulari è stata la seguente: 1) gating su popolazione negativa al lignaggio delle cellule T e NK (CD3-CD56-CD16-); 2) gate su CD71+ (recettore della transferrina espresso in lignaggio eritroide e LMA che consente il rilevamento di cellule K562 residue). Questa strategia di gating ha permesso la valutazione delle cellule CD3-CD16-CD56-CD71+, che sono l'aAPC (K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (definito "K562 residuo" nella Figura 4).

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.