Method Article

Un metodo efficiente per l'induzione di cellule simili a epatociti diretti da cellule staminali embrionali umane

DOI:

10.3791/62654

⸱

May 6th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule funzionali simili a epatociti (HHC) completando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le potenziali funzioni delle cellule simili agli epatociti (HLC) derivate da cellule staminali embrionali umane (hESC) promettono molto per la modellazione delle malattie e le applicazioni di screening farmacologico. Ecco un metodo efficiente e riproducibile per la differenziazione degli hESC in HHC funzionali. L'istituzione di un lignaggio endodermo è un passo fondamentale nella differenziazione agli HLC. Con il nostro metodo, regolamentiamo le vie di segnalazione chiave integrando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE), seguita dalla generazione di cellule progenitrici epatiche e infine HHC con morfologia tipica degli epatociti in un metodo scenico con reagenti completamente definiti. Gli HHLC derivati dall'hESC prodotti con questo metodo esprimono marcatori specifici del palco (tra cui albumina, Il recettore nucleare HNF4α e il polipeptide cotrasportante taurocorato di sodio (NTCP)) e mostrano caratteristiche speciali relative agli epatociti maturi e funzionali (tra cui colorazione verde indocyanina, stoccaggio di glicogeno, colorazione ematossilina-eosina e attività CYP3) e possono fornire una piattaforma per lo sviluppo di applicazioni basate su HLC nello studio delle malattie epatiche.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il fegato è un organo altamente metabolico che svolge diversi ruoli, tra cui la disossidazione, la conservazione del glicogeno e la secrezione e la sintesi delle proteine1. Vari agenti patogeni, farmaci ed eremita possono causare cambiamenti patologici nel fegato e influenzare le suefunzioni 2,3. Gli epatociti, come principale unità funzionale del fegato, svolgono un ruolo importante nei sistemi di supporto epatico artificiale e nell'eliminazione della tossicità dei farmaci. Tuttavia, la risorsa degli epatociti umani primari è limitata nella terapia a base cellulare, così come nella ricerca sulle malattie del fegato. Pertanto, lo sviluppo di nuove fonti di epatociti umani funzionali è un'importante direzione di ricerca nel campo della medicina rigenerativa. Dal 1998, quando gli hESCsono stati istituiti 4, gli hESC sono stati ampiamente considerati dai ricercatori a causa del loro potenziale di differenziazione superiore (possono differenziarsi in vari tessuti in un ambiente adatto) e dell'alto grado di autorela rinnovabilità, e quindi forniscono cellule di origine ideali per epatici bioartifici, trapianto di epatociti e persino ingegneria del tessutoepatico 5.

Attualmente, l'efficienza di differenziazione epatica può essere notevolmente aumentata arricchendo l'endoderma6. Nella differenziazione del lignaggio delle cellule staminali in endoderma, i livelli del fattore di crescita trasformante β (TGF-β) e le vie di segnalazione WNT sono i fattori chiave nel nodo dello stadio di formazione dell'endoderma. L'attivazione di un alto livello di segnalazione TGF-β e WNT può promuovere lo sviluppo di endoderm7,8. Activin A è una citochina appartenente alla superfamiglia TGF-β. Pertanto, l'attivina A è ampiamente utilizzata nell'induzione endoderma di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) ehESC 9,10. La GSK3 è una proteina chinasi serina-treonina. I ricercatori hanno scoperto che CHIR99021, uno specifico inibitore di GSK3β, può stimolare i tipici segnali WNT e può promuovere la differenziazione delle cellule staminali in determinate condizioni, suggerendo che CHIR99021 ha il potenziale per indurre la differenziazione delle cellule staminali in endoderma 11,12,13.

Qui riferiamo un metodo efficiente e riproducibile per indurre efficacemente la differenziazione degli hESC in HHC funzionali. L'aggiunta sequenziale di Activin A e CHIR99021 ha prodotto circa 89,7±0,8% cellule SOX17 (marcatore DE)positive. Dopo essere state ulteriormente maturate in vitro, queste cellule hanno espresso marcatori specifici epatici e esercitato morfologia epatocitaria (basata sulla colorazione ematossilina-eosina (H & E)) e funzioni, come l'assorbimento di verde indocyanina (ICG), stoccaggio di glicogeno e attività CYP3. I risultati mostrano che gli hESC possono essere differenziati con successo in HHC funzionali maturi con questo metodo e possono fornire una base per la ricerca correlata alle malattie epatiche e lo screening in vitro dei farmaci.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Manutenzione delle cellule staminali

NOTA: Il protocollo di manutenzione delle celle descritto di seguito si applica alla linea cellulare hES03 mantenuta in un monostrato aderente. Per tutti i seguenti protocolli in questo manoscritto, le celle devono essere maneggiate sotto un armadietto di sicurezza biologico.

  1. Preparare un mezzo di coltura di cellule staminali 1x mTesR diluire 5x mezzo supplementare a mTesR mezzo di base.
  2. Preparare un supporto Matrigel qualificato 30x hESC diluire 5 mL di Matrigel qualificato hESC con 5 mL di DMEM / F12 sul ghiaccio. Conservare a -20 °C.
  3. Preparare un supporto Matrigel qualificato 1x hESC diluire 33,3 μL di Matrigel qualificato hESC 30x con 1 mL di DMEM/F12.
  4. Rivestire sterili 6 piastre trattate con coltura tissutale con 1 mL di Matrigel qualificato hESC in ogni con largo anticipo e conservare a 4 °C durante la notte. Lasciare a temperatura ambiente (RT) per almeno 30 minuti prima dell'uso.
  5. Scongelare gli hESC crioconservati in un bagno d'acqua a 37 °C per 3 minuti senza tremare. Quindi trasferire immediatamente le celle tubazioni in un tubo di centrifuga da 15 ml contenente 4 mL prebellico mezzo 37 °C mTesR, pipetta su e giù delicatamente 2 volte.
  6. Centrifugare gli hESC a 200 x g per 2 minuti a RT.
  7. Aspirare il supernatante e rimescolare delicatamente le cellule in 1 mL di mezzo mTesR.
  8. Aspirare il mezzo DMEM/F12 dalla piastra e seminare le cellule in un pozzo di piastra a 6 porri ad una densità di 1 x 105 celle in 2 mL di mTesR.
  9. Incubare in un incubatore di CO2 al 5% e mantenere le cellule sostituendo con mTesR preriscaldato ogni giorno. Passare le cellule a circa il 70-80% di confluenza o quando le colonie cellulari iniziano a prendere contatto.

2. Passaggio e differenziazione delle cellule staminali

  1. Per le cellule passanti, aspirare il mezzo e incubare le cellule con 1 mL per pozzo di soluzione enzimatica (ad esempio, Accutasi per 5 min a 37 °C. Quindi trasferire le celle con pipettaggio su un tubo di centrifuga da 15 ml contenente 4 ml di DMEM/F12 prebellico a 37 °C.
  2. Centrifugare le cellule a 200 x g a RT per 2 min.
  3. Aspirare il mezzo e rimorsi delicatamente il pellet cellulare in 1 mL di mezzo mTesR.
  4. Preparare piastre da 24 pozzi rivestendo con 250 μL di 1x hESC qualificato Matrigel medio in anticipo. Seme hESC come descritto sopra ad una densità di 1 - 1,5 x 105 cellule per pozzo in 500 μL di mezzo mTesR.
  5. Lasciare incubare le cellule per 24 ore a 37 °C in un incubatore di CO2.

3. Formazione DE

  1. Preparare soluzioni stock di 100 μg/mL Activin A con DPBS contenente 0,2% BSA e 3 mM CHIR99021 con DMSO.
  2. Preparare il mezzo di base di differenziazione stage I integrando il mezzo RPMI con 1x B27.
  3. Aggiungere l'attivina A ad una concentrazione finale di 100 ng/mL e CHIR99021 ad una concentrazione finale di 3 μM in un volume appropriato di mezzo di base di differenziazione preriscaldato di stadio I.
  4. Aspirare il mezzo mTesR dalle cellule e sostituire con mezzi di differenziazione di fase I contenenti fattori di differenziazione aggiunti (ad esempio, 0,5 mL per pozzo di una piastra da 24 pomp pouf).
  5. Lasciare che le cellule incubano per 3 giorni a 37 °C in un incubatore di CO2, sostituendo quotidianamente i supporti di fase I con fattori di differenziazione appena aggiunti (giorni 0-2).
    NOTA: Dopo 3 giorni di differenziazione, le cellule differenziate devono esprimere marcatori di cellule DE, come FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 e FOXA1 (minimo 80% di SOX17 necessario per procedere).

4. Differenziazione delle cellule progenitrici epatiche

  1. Preparare i supporti di base di differenziazione stage II sciogliendo la sostituzione del siero knockout (KOSR) a una concentrazione finale del 20% in KNOCK OUT DMEM.
  2. Preparare il mezzo di differenziazione stadio II contenente 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1 soluzione di amminoacido non essenziale (NEAA), 100 μM 2-mercaptoetanolo e 1x penicillina/streptomicina (P/S) al volume appropriato di KOSR/knockout DMEM.
  3. Il giorno 3 di differenziazione, aspirare il mezzo e sostituire con il mezzo di stadio II (ad esempio, 0,5 mL per pozzo di una piastra di 24 pozza). Quindi incubare per 24 ore.
  4. Il giorno 4 di differenziazione, aspirare il mezzo e sostituire con il mezzo di stadio II (ad esempio, 1 mL per pozzo di una piastra di 24 pozza).
  5. Cambia il mezzo a giorni diversi (sostituisci il mezzo il giorno 6).
    NOTA: Dopo 8 giorni di differenziazione, le cellule differenziate devono esprimere marcatori appropriati di cellule progenitrici epatiche, come HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (minimo 80% di HNF4α necessario per procedere).

5. Differenziazione degli epatociti

  1. Preparare 10 μg/mL di fattore di crescita epatocito (HGF), 20 μg/mL Di soluzioni stock di oncostatina (OSM) con DBPS (contenente 0,2% di BSA) e filtrare con una membrana filtrante da 0,22 μm.
  2. Preparare il mezzo di base di differenziazione di fase III (mezzo HepatoZYME-SFM (HZM) integrato con 10 μM idrocortisone-21-emisuccinato e 1x P/S).
  3. Aggiungere HGF ad una concentrazione finale di 10 ng/mL e OSM ad una concentrazione finale di 20 ng/mL al volume appropriato del mezzo di differenziazione preriscaldato di stadio III.
  4. Il giorno 8 di differenziazione, aspirare il mezzo di stadio II dalle cellule e sostituire con il mezzo di stadio III (ad esempio, 1 mL per pozzo di una piastra di 24 pozza).
  5. Lasciare che le cellule incubano per 10 giorni a 37 °C in un incubatore di CO2, cambiando i supporti di fase III a giorni diversi con fattori di differenziazione appena aggiunti (giorni 8-18).
    NOTA: Dopo 18 giorni di differenziazione, le cellule differenziate devono esprimere marcatori caratteristici di epatociti, come AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. La percentuale di cellule positive all'albumina di solito è superiore al 90%.

6. Isolamento dell'RNA, sintesi cDNA e analisi RT-qPCR

  1. Aspirare il mezzo dalle cellule e aggiungere la giusta quantità di reagente RNAiso Plus, (ad esempio, 0,3 mL per pozzo di una piastra da 24 po '). Raccogliere il supernatante in un tubo da 1,5 ml e lasciare riposare a RT per 5 minuti.
  2. Aggiungere 60 μL di reagente cloroformio e lasciarlo a RT per 5 minuti. Quindi centrifuga a 12.000 x g per 15 minuti.
  3. Raccogliere il supernatante da 125 μL e trasferirlo in un altro tubo di centrifuga. Aggiungere 160 μL di isopropanolo, mescolare bene e stare a RT per 10 minuti.
  4. Centrifuga a 12.000 x g per 10 min.
  5. Rimuovere il supernatante, aggiungere il 75% di etanolo al precipitato e centrifugare a 7.500 x g per 5 min.
  6. Dopo l'essiccazione a RT, aggiungere 40 μL di acqua trattata con DEPC per dissolversi. Per qPCR, trascrivere inversa 2 μg di RNA totale con un kit di trascrizione inversa secondo il protocollo del produttore.
  7. Eseguire RT-qPCR utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore.
  8. Normalizzare l'espressione genica rispetto alle cellule staminali non indotte e determinare la variazione di piegatura dopo la normalizzazione a GAPDH.

7. Immunofluorescenza Convalida della differenziazione

  1. Preparare 1 tampone di lavaggio PBST aggiungendo 0,1% Tween-20 a PBS.
  2. Aspirare il mezzo dalle cellule aderenti e lavare brevemente con PBS a RT su uno shaker.
  3. Aspirare pbs e incubare cellule con 500 μL di metanolo ghiacciato per pozzo di una piastra da 24 po 'per fissare le cellule a -20 °C durante la notte.
  4. Rimuovere il metanolo e lavare le cellule 3 volte con PBS su uno shaker per 10 minuti ogni volta a RT.
  5. Celle a blocchi con 500 μL di 5% di BSA preparate in PBS per 1-2 h a RT su uno shaker.
  6. Diluire l'anticorpo primario a 1: 200 nella stessa soluzione utilizzata per il blocco.
  7. Incubare le cellule fisse in una soluzione di anticorpi primari da 300 μL durante la notte a 4 °C su uno shaker.
  8. Dopo l'incubazione notturna, lavare le cellule 3 volte con PBST per 10 minuti ogni volta a RT su uno shaker.
  9. Preparare la soluzione anticorpale secondaria in soluzione di blocco a 1:1000.
  10. Incubare in 300 μL di soluzione anticorpale secondaria protetta dalla luce per 1 h a RT su uno shaker.
  11. Aspirare la soluzione di anticorpi secondari e lavare le cellule 3 volte con PBST per 10 minuti ogni volta a RT su uno shaker.
  12. Incubare le cellule con 300 μL di 1 μg/mL DAPI per 3-5 minuti, quindi lavare due volte con PBST.
  13. Dopo aver aspirato pbst, aggiungere una quantità appropriata di PBS per scattare foto al microscopio a fluorescenza.

8. Analisi western delle macchie

  1. Preparare 1 tampone di lavaggio TBST aggiungendo lo 0,1% di Interpol-20 alla soluzione salina tamponata tris (TBS).
  2. Preparare il buffer di elettroforesi SDS-PAGE e il buffer di trasferimento occidentale utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore.
  3. Risolvere la proteina cellulare totale (40 μg) su un gel di poliacrilammide di solfato di dodecil di sodio al 10% ed eseguire in tampone di elettroforesi SDS-PAGE a corrente costante di 15 mA per circa 2 ore.
  4. Trasferire il gel su una membrana difluoruro di polivinilidene (PVDF) a corrente costante di 300 mA per 2 ore a bassa temperatura.
    NOTA: Il tempo di esecuzione e il tempo di trasferimento possono variare a seconda dell'attrezzatura utilizzata e del tipo e della percentuale del gel.
  5. Bloccare la membrana con il 3% di BSA preparato in TBST per 1 h a RT su uno shaker.
  6. Incubare in soluzione di anticorpi primari (1:1000 diluizione) durante la notte a 4 °C su uno shaker.
  7. Dopo l'incubazione notturna, lavare la membrana assorbitrice 3 volte con TBST per 15 minuti alla volta a RT su uno shaker.
  8. Incubare in soluzione anticorpale secondaria (diluizione 1:2000) per 2 ore a RT su uno shaker.
  9. Scartare la soluzione anticorpale secondaria e lavare la membrana 3 volte con TBST, per 15 minuti ogni volta, a RT su uno shaker.
  10. Visualizza le bande immunoreattive usando un reagente di chemiluminescenza seguito dall'autorazione. Utilizzare β-actin come controllo di caricamento.

9. Assorbimento verde indocyanina

  1. Preparare soluzione di stock verde indocyanina da 200 mg/mL in DMSO.
  2. Preparare una soluzione di lavoro integrando il mezzo di differenziazione di fase III con soluzione verde indocyanina ad una concentrazione finale di 1 mg/mL.
  3. Incubare in un incubatore di 37 °C, 5% CO2 per 1-2 h.
  4. Aspirare il mezzo e lavare le cellule 3 volte con PBS.
  5. Fotografa al microscopio.

10. Colorazione periodica acido-schiff (PAS) e colorazione ematossilina-eosina (H&E)

  1. Aspirare il mezzo dalle cellule aderenti e lavare brevemente due volte con PBS.
  2. Per la fissazione cellulare, aspirare pbs e incubare le cellule con metanolo ghiacciato a -20 °C durante la notte.
  3. Visualizza lo stoccaggio del glicogeno mediante colorazione PAS e osserva le cellule binucleate mediante colorazione H & E utilizzando un kit seguendo le istruzioni del produttore.
  4. Scatta immagini con un microscopio a fluorescenza.

11. Saggio per l'attività cyp

  1. Misura l'attività cyp450 utilizzando saggi a base cellulare disponibili in commercio (test P450-Glo) secondo le istruzioni del produttore.
  2. Utilizzare tre ripetizioni indipendenti per il test. I dati sono rappresentati come la media ± SD.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il diagramma schematico dell'induzione HLC dagli hESC e le immagini rappresentative dei campi luminosi di ogni fase di differenziazione sono mostrati nella figura 1. Nella fase I, l'attivina A e il CHIR99021 sono stati aggiunti per 3 giorni per indurre le cellule staminali a formare cellule endodermiche. Nello stadio II, le cellule endodermiche si differenziano in cellule progenitrici epatiche dopo essere state trattate con mezzo di differenziazione per 5 giorni. Nella terza fase, i primi ep...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un metodo graduale che induce gli HLC dagli hESC in tre fasi. Nella prima fase, Activin A e CHIR99021 sono stati utilizzati per differenziare gli hESC in DE. Nel secondo stadio, KO-DMEM e DMSO sono stati usati per differenziare DE in cellule progenitrici epatiche. Nel terzo stadio, HZM più HGF, OSM e sale di sodio idrocortisone 21-emisuccinato sono stati usati per continuare a differenziare le cellule progenitrici epatiche in HHC.

Durante l'utilizzo del protocollo è necessario ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81870432 e 81570567 to X.L.Z.), (n. 81571994 to P.N.S.); la Fondazione di Scienze Naturali della Provincia del Guangdong, Cina (n. 2020A1515010054 a P.N.S.), La Fondazione Universitaria Li Ka Shing Shantou (n. L1111 dal 2008 al P.N.S.). Desideriamo ringraziare il Prof. Stanley Lin dello Shantou University Medical College per i consigli utili.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoetanoloSigmaM7522Per la differenziazione del progenitore epatico
488 marcato capra contro topo IgGZSGB-BIOZF-0512Per IF, secondo anticorpo
488 capra marcato contro IgG DI CONIGLIOZSGB-BIOZF-0516Per IF, secondo anticorpo
AccutaseStem Cell Technologies7920Per il passaggio cellulare
Activina ApeproTech120-14EPer la formazione definitiva dell'endoderma
Anti - Albumina (ALB)Sigma-AldrichA6684Per IF e WB, anticorpo primario
Anti - Human Oct4AbcamAb19587Per IF, anticorpo primario
Anti - &alfa;-Fetoproteina (AFP)Sigma-AldrichA8452Per IF e WB, anticorpo primario
Anti -SOX17Abcamab224637Per IF, anticorpo primario
Anti-Epatocita Fattore Nucleare 4 alfa (HNF4&alfa;)Sigma-AldrichSAB1412164Per IF, anticorpo primario
B-27 IntegratoreGibco17504-044Per la formazione definitiva dell'endoderma
BSABeyotimeST023-200gPer il blocco cellulare
CHIR99021Sigma-AldrichPer la formazione definitiva dell'endoderma
DAPIBeyotimeC1006Per la
DEPC-waterBeyotimeR0021Per la dissoluzione dell'RNA
DM3189MCEHY-12071Per la formazione definitiva dell'endoderma
DMEM/F12Gibco11320-033Per coltura cellulare
DMSOSigma-AldrichD5879Per la differenziazione dei progenitori epatici
DPBSGibco14190-144Per la coltura cellulare
GlutaMAXGibco35050-061Per la differenziazione del progenitore epatico
H& Kit di colorazione EBeyotimeC0105Sper H& Colorazione E Fattore di
crescita degli epatociti (HGF)peproTech100-39Per la differenziazione degli epatociti
HepatoZYME-SFM (HZM)Gibco17705-021Per la differenziazione degli epatociti
Idrocortisone-21-emiuccinatoSigma-AldrichH4881Per la differenziazione degli epatociti
IndocianinaSangon BiotechA606326Per la colorazione dell'indocianina
Knock Out DMEMGibco10829-018Per la differenziazione dei progenitori epatici
Knock Out SR Multi-SpeciesGibcoA31815-02Per la differenziazione dei progenitori epatici
Matrigel 354277 Corning qualificato hESCPer colture cellulari
MEM NeAAGibco11140-050Per la differenziazione dei progenitori epatici
mTesR 5X IntegratoreStem Cell Technologies85852Per colture cellulari
mTesR Basal MediumStem Cell Technologies85851Per colture cellulari
Oncostatina (OSM)peproTech300-10Per la differenziazione degli epatociti
P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)PromegaV8901Per l'attività del CYP450
Kit di colorazione PASSolarbioG1281Per la colorazione PAS
Pen/StrepGibco15140-122Per la differenziazione cellulare
Perossidasi-Capra coniugata anti-Topo IgGZSGB-BIOZB-2305Per WB, secondo anticorpo Anticorpo
primario Tampone di diluizione per  Western BlotBeyotimeP0256Per la diluizione degli anticorpi primari
Kit ReverTraAce qPCR RTTOYOBOFSQ-101Per la sintesi del cDNA
RNAiso PlusTaKaRa9109Per l'isolamento dell'RNA
RPMI 1640Gibco11875093Per la formazione definitiva dell'endoderma
Latte scrematoSangon BiotechA600669Per la preparazione del secondo anticorpo
SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742Per analisi RT-PCR
Torin2MCEHY-13002Per la formazione definitiva dell'endoderma
TweenSigma-AldrichWXBB7485VPer la preparazione del tampone di lavaggio
SML1046 colorazione nucleare

References

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