Migrazione nucleare nell'ovocita di Drosophila

Sommario

In Drosophila, il nucleo dell'ovocita subisce una migrazione microtubule-dipendente durante l'oogenesi. Qui, descriviamo un protocollo che è stato sviluppato per seguire la migrazione eseguendo l'imaging dal vivo su camere di uova ex-vivo. La nostra procedura mantiene in vita le camere delle uova per 12 ore per acquisire filmati time-lapse 3D multi-posizione utilizzando la microscopia confocale a disco rotante.

Abstract

L'imaging di cellule vive è particolarmente necessario per comprendere i meccanismi cellulari e molecolari che regolano i movimenti degli organelli, i riarrangiamenti del citoscheletro o il pattern di polarità all'interno delle cellule. Quando si studia il posizionamento del nucleo ovocitario, le tecniche di live-imaging sono essenziali per catturare gli eventi dinamici di questo processo. La camera dell'uovo Di Drosophila è una struttura multicellulare e un eccellente sistema modello per studiare questo fenomeno a causa delle sue grandi dimensioni e della disponibilità di numerosi strumenti genetici. Durante la Mid-oogenesi della Drosophila, il nucleo migra da una posizione centrale all'interno dell'ovocita per adottare una posizione asimmetrica mediata da forze generate da microtubuli. Questa migrazione e il posizionamento del nucleo sono necessari per determinare gli assi di polarità dell'embrione e della successiva mosca adulta. Una caratteristica di questa migrazione è che si verifica in tre dimensioni (3D), creando una necessità per l'imaging dal vivo. Pertanto, per studiare i meccanismi che regolano la migrazione nucleare, abbiamo sviluppato un protocollo per la coltura delle camere delle uova sezionate ed eseguire l'imaging dal vivo per 12 ore mediante acquisizioni time-lapse utilizzando la microscopia confocale a disco rotante. Nel complesso, le nostre condizioni ci consentono di preservare in vita le camere delle uova di Drosophila per un lungo periodo di tempo, consentendo così di visualizzare il completamento della migrazione nucleare in un gran numero di campioni in 3D.

Introduzione

Per diversi anni, l'ovocita Drosophila è emerso come un sistema modello per studiare la migrazione nucleare. L'ovocita Drosophila si sviluppa in una struttura multicellulare chiamata camera dell'uovo. Le camere degli ovuli comprendono 16 cellule germinali (15 cellule nutrici e l'ovocita) circondate da uno strato epiteliale di cellule somatiche follicolari. Lo sviluppo della camera d'uovo è stato suddiviso in 14 fasi (Figura 1A), durante le quali l'ovocita crescerà e accumulerà le riserve necessarie per lo sviluppo precoce dell'embrione. Durante lo sviluppo, dopo la riorganizzazione dei microtubuli e il trasporto asimmetr....

Protocollo

1. Preparazione del mezzo di imaging

1. Preparare supporti freschi il giorno dell'uso. Pipetta 200 μL di mezzo Schneider (contenente L-Glutammina e 0,40 g/L di NaHCO₃ integrati con il 10% di siero fetale per polpaccio inattivato dal calore, 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina).
2. Integratore con 30 μL di insulina 10 mg/mL.
3. Aggiungere 4 μL di siero fetale per polpaccio inattivato dal calore.

2. Preparazione della camera di osservazione

1. Con una punta della pipetta, applicare una piccola quantità di grasso siliconico intorno al foro sul lato inferiore della slitta forata (

Risultati

Prima della migrazione, il nucleo è dinamico e oscilla attorno a una posizione centrale durante un periodo definito come pre-migrazione. Questi piccoli movimenti riflettono un equilibrio di forze di spinta e trazione che mantengono l'equilibrio nel mezzo dell'ovocita. Quantificando le traiettorie dei nuclei, abbiamo dimostrato che le traiettorie APM e LPM avevano proporzioni simili. Definiamo la natura della traiettoria dal primo contatto tra il nucleo e la membrana plasmatica⁶. Pertanto, il nucle.......

Discussione

Altri protocolli descrivono come preparare e coltura le camere per uova di Drosophila ex vivo per il saggio di imaging dal vivo^12,13. La novità di questo protocollo è l'uso di una camera di imaging costruita utilizzando un vetrino di alluminio cavo, un coverslip e una membrana permeabile A O₂/ CO_2. Il vantaggio principale di questa configurazione è quello di limitare il movimento in Z senza esercitare pressione sul campione. Pertant.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cuscinetto CO2 per anestesia	Dutscher	789060	Mosche per anestesia
Vetrino coprioggetti (24x50 mm)	Knittel Glass	VD12450Y100A	Preparazione della camera di osservazione
Pinze Dumont #5	Carl Roth	K342.1	Dissezione
Aghi in acciaio inox	Entosphinx	20	Dissezione
Siero fetale di vitello inattivato a caldo	SIGMA-ALDRICH	F7524	Terreno di imaging
Soluzione di insulina pancreas bovino	SIGMA-ALDRICH	10516 - 5ml	Terreno di imaging
di penicilina/streptomicina	SIGMA-ALDRICH	P0781	Terreno di imaging
Membrana permeabile	Leica	11521746	Preparazione della camera di osservazione
Schneider Medium	Pan Biotech	P04-91500	Mezzo di imaging
Grasso al silicio	BECKMAN COULTER	335148	Preparazione della camera di osservazione
Disco rotante confocale	Zeiss	CSU-X1	Osservazione della migrazione nucleare
Olio di Voltalef 10S	VWR	24627 - 188	Preparazione della camera di osservazione

Soluzione