Articolo metodologico

Migrazione nucleare nell'ovocita di Drosophila

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DOI:

10.3791/62688

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13 maggio 2021

 ,  , 
1Université de Paris, CNRS, Institut Jacques Monod

In questo articolo

Sommario

In Drosophila, il nucleo dell'ovocita subisce una migrazione microtubule-dipendente durante l'oogenesi. Qui, descriviamo un protocollo che è stato sviluppato per seguire la migrazione eseguendo l'imaging dal vivo su camere di uova ex-vivo. La nostra procedura mantiene in vita le camere delle uova per 12 ore per acquisire filmati time-lapse 3D multi-posizione utilizzando la microscopia confocale a disco rotante.

Abstract

L'imaging di cellule vive è particolarmente necessario per comprendere i meccanismi cellulari e molecolari che regolano i movimenti degli organelli, i riarrangiamenti del citoscheletro o il pattern di polarità all'interno delle cellule. Quando si studia il posizionamento del nucleo ovocitario, le tecniche di live-imaging sono essenziali per catturare gli eventi dinamici di questo processo. La camera dell'uovo Di Drosophila è una struttura multicellulare e un eccellente sistema modello per studiare questo fenomeno a causa delle sue grandi dimensioni e della disponibilità di numerosi strumenti genetici. Durante la Mid-oogenesi della Drosophila, il nucleo migra da una posizione centrale all'interno dell'ovocita per adottare una posizione asimmetrica mediata da forze generate da microtubuli. Questa migrazione e il posizionamento del nucleo sono necessari per determinare gli assi di polarità dell'embrione e della successiva mosca adulta. Una caratteristica di questa migrazione è che si verifica in tre dimensioni (3D), creando una necessità per l'imaging dal vivo. Pertanto, per studiare i meccanismi che regolano la migrazione nucleare, abbiamo sviluppato un protocollo per la coltura delle camere delle uova sezionate ed eseguire l'imaging dal vivo per 12 ore mediante acquisizioni time-lapse utilizzando la microscopia confocale a disco rotante. Nel complesso, le nostre condizioni ci consentono di preservare in vita le camere delle uova di Drosophila per un lungo periodo di tempo, consentendo così di visualizzare il completamento della migrazione nucleare in un gran numero di campioni in 3D.

Introduzione

Per diversi anni, l'ovocita Drosophila è emerso come un sistema modello per studiare la migrazione nucleare. L'ovocita Drosophila si sviluppa in una struttura multicellulare chiamata camera dell'uovo. Le camere degli ovuli comprendono 16 cellule germinali (15 cellule nutrici e l'ovocita) circondate da uno strato epiteliale di cellule somatiche follicolari. Lo sviluppo della camera d'uovo è stato suddiviso in 14 fasi (Figura 1A), durante le quali l'ovocita crescerà e accumulerà le riserve necessarie per lo sviluppo precoce dell'embrione. Durante lo sviluppo, dopo la riorganizzazione dei microtubuli e il trasporto asimmetrico dei determinanti materni, l'ovocita si polarizza lungo gli assi antero-dorsale e dorso-ventrale. Questi assi determinano i successivi assi di polarità dell'embrione e dell'adulto derivanti dalla fecondazione di questo ovocita1. Durante l'oogenesi, il nucleo adotta una posizione asimmetrica nell'ovocita. Nella fase 6, il nucleo è centrato nella cellula. Su un segnale ancora da identificare emesso dalle cellule follicolari posteriori che viene ricevuto dall'ovocita, il nucleo migra verso l'intersezione tra le membrane plasmatiche anteriore e laterale nello stadio 7 (Figura 1B)2,3. Questa posizione asimmetrica è necessaria per indurre la determinazione dell'asse dorso-ventrale.

Microscopia a fluorescenza della camera uovo di Drosophila, che mostra gli stadi dei nuclei delle cellule ovocitarie e nutrici.
Figura 1: Drosophila melanogaster camere d'uovo. (A) Ovariole fisso da mosche transgeniche che esprimono Fs(2)Ket-GFP che etichetta gli involucri nucleari e ubi-PH-RFP che etichetta le membrane plasmatiche. L'ovariole è composto da camere per uova in via di sviluppo in diverse fasi. La maturazione aumenta lungo l'asse antero-posteriore con il germario sulla punta anteriore (a sinistra) dove risiede la cellula staminale germinale e lo stadio più vecchio sulla punta posteriore (a destra). (B) Proiezione Z della camera dell'uovo vivente mediante microscopia confocale a disco rotante allo stadio 6 dell'oogenesi (a sinistra), in cui il nucleo è centrato nell'ovocita. Il nucleo migrerà per adottare una posizione asimmetrica allo stadio 7 (a destra) a contatto con la membrana plasmatica anteriore (tra l'ovocita e la cellula nutrice) e la membrana plasmatica laterale (tra l'ovocita e le cellule follicolari). Questa posizione indurrà la determinazione del lato dorsale e, quindi, dell'asse dorso-ventrale della camera dell'uovo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per molti decenni, questa migrazione nucleare è stata studiata su tessuti fissi mediante immuno colorazione. Questo approccio ha notevolmente permesso di dimostrare che questo processo dipende da una fitta rete di microtubuli4,5. Più recentemente, abbiamo sviluppato un protocollo che offre condizioni compatibili con l'imaging dal vivo dell'ovocita per diverse ore che consentono di studiare questo processo in modo dinamico6.

Quindi, per la prima volta, siamo stati in grado di descrivere che il nucleo ha traiettorie preferenziali e caratteristiche durante la sua migrazione, una lungo la membrana plasmatica anteriore (APM) e un'altra lungo la membrana plasmatica laterale (LPM) dell'ovocita (Figura 2). Questi ultimi risultati sottolineano l'importanza dei protocolli di live-imaging quando si studiano processi dinamici come la migrazione nucleare.

<span>Diagramma dell'oogenesi: ovocita, cellule nutrici, cellule follicolari; direzione degli assi e differenziamento cellulare.</span>
Figura 2: Rappresentazione schematica dei diversi percorsi di migrazione del nucleo. Allo stadio 6 dell'oogenesi, l'ovocita è una grande cellula con un nucleo centrale. In questa fase, l'asse di polarità antero-posteriore è impostato con una membrana plasmatica posteriore/laterale dell'ovocita a contatto con le cellule follicolari e la membrana plasmatica anteriore (in giallo) è in contatto con le cellule nutrici2. Abbiamo precedentemente riportato che il nucleo potrebbe migrare lungo la membrana plasmatica anteriore (APM), lungo la membrana plasmatica laterale (LPM), o attraverso il citoplasma (STAD, direttamente alla corteccia antero-dorsale)6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La migrazione del nucleo ovocitario è un fenomeno di circa 3 h6e finora l'evento che innesca l'inizio della migrazione effettiva è sconosciuto. L'inizio della migrazione può anche essere ritardato dai mutanti proteici utilizzati per studiare questo meccanismo. Queste variabili sconosciute ci hanno motivato ad acquisire immagini per lunghi periodi di tempo (10-12 ore). È quindi importante garantire che gli ovociti rimangano vivi. Man mano che la camera dell'uovo si sviluppa, si allunga lungo l'asse antero-posteriore da una forma sferica a una ellittica. Questo allungamento è guidato dalla rotazione delle cellule follicolari, che si verifica dallo stadio 1 allo stadio 8, perpendicolare all'asse antero-posteriore7. Inoltre, una guaina tubolare di muscolo con proprietà pulsatile circonda le camere delle uova. La sua funzione fisiologica è quella di spingere i follicoli in via di sviluppo verso l'ovidotto continuamente8. Al fine di limitare i movimenti che inducono oscillazioni delle camere delle uova dopo la loro dissezione, abbiamo progettato una microcamera di osservazione di 150 μm di altezza (Figura 3A). Questa altezza è leggermente superiore alla dimensione di un follicolo negli stadi 10 e 11. Limita considerevolmente i movimenti verticali del campione preservando la rotazione della camera delle uova, con conseguenti difetti limitati nello sviluppo del follicolo. Eseguiamo quindi l'imaging dal vivo per 12 ore su camere di uova sezionate mediante acquisizioni time-lapse multi-posizione utilizzando un microscopio confocale a disco rotante. Qui descriviamo il nostro protocollo per studiare la migrazione nucleare degli ovociti tra gli stadi 6 e 7.

Schema della camera microfluidica; dimensioni, dettagli di assemblaggio e utilizzo del grasso siliconico per l'osservazione biologica.
Figura 3: Rappresentazione schematica della camera di osservazione. (A) (Vista dall'alto) Dimensioni precise della slitta di alluminio con le altezze (A') e le circonferenze (A'') del pozzo perforato al centro della slitta. (B) (vista in basso) Un coperchio che blocca il pozzo è sigillato al vetrino con grasso di silicio. (C) (Vista dall'alto) Gli ovarioli sezionati si sviluppano in un mezzo di imaging coperto da una membrana permeabile ai gas. L'olio di alocarbonio viene utilizzato per stabilizzare la membrana. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per seguire la migrazione nucleare e valutare con precisione le traiettorie nell'ovocita, sono necessari marcatori sia per l'involucro nucleare che per la membrana plasmatica. A tal fine, sono stati selezionati due transgeni che hanno un elevato rapporto segnale/rumore e non svaniscono nel corso dell'imaging dal vivo. Per etichettare la membrana plasmatica, si raccomanda l'uso di un P[ubi-PH-RFP] che codifica il dominio Pleckstrin Homology (PH) della Fosfolipasi C Umana ∂1 (PLC∂1) fuso a RFP. Questo dominio PH si lega al fosfoinositide PI(4,5)P2 distribuito lungo la membrana plasmatica dell'ovocita9. Per l'involucro nucleare, il ceppo di trappola proteica P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP in cui GFP è inserito all'interno del gene che codifica per la Drosophila ß-importina mostra un segnale omogeneo e intenso10. Le giovani mosche (1-2 giorni) vengono poste in fiale fresche contenenti lievito secco 24-48 ore prima della dissezione ovarica.

Per questo test di live-imaging, un pezzo di alluminio di 1 mm di spessore, che non è reattivo per il campione, è stato tagliato nelle dimensioni di un vetrino di microscopia. Ha un foro di 16 mm di diametro al centro della slitta che è stato controforato a 0,85 mm. Questo foro di controforo ha un foro aggiuntivo di 6 mm di diametro con una profondità di 150 μm (Figura 3A). Un coverslip è incollato con grasso siliconico (inerte per il campione) nella parte inferiore della camera di alluminio (Figura 3B). Dopo aver posizionato i campioni nel pozzo riempito a medio, una membrana permeabile allo scambio O2/ CO2 viene posizionata sul mezzo e circondata da olio di alocarbonio (Figura 3C).

Per la dissezione, si consiglia di utilizzare pinci in acciaio inossidabile con una dimensione della punta di 0,05 x 0,02 mm e aghi di diametro 0,20 mm per la separazione degli ovarioli (Figura 4B,C). I nuclei migratori sono ripresi su un microscopio confocale invertito a disco rotante CSU-X1 dotato di una telecamera. Le immagini multi-posizione sono state acquisite mediante time-lapse ogni 15 minuti a 24 °C. Un intervallo di 15 minuti consente di eseguire acquisizioni multi-posizione con fotosbiancamento limitato delle proteine fluorescenti e fototossicità per i campioni. Inoltre, un intervallo più breve non fornirebbe dati molto più informativi per seguire le traiettorie nucleari. I filmati vengono elaborati e analizzati tramite il software Fiji11.

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Protocollo

1. Preparazione del mezzo di imaging

  1. Preparare supporti freschi il giorno dell'uso. Pipetta 200 μL di mezzo Schneider (contenente L-Glutammina e 0,40 g/L di NaHCO3 integrati con il 10% di siero fetale per polpaccio inattivato dal calore, 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina).
  2. Integratore con 30 μL di insulina 10 mg/mL.
  3. Aggiungere 4 μL di siero fetale per polpaccio inattivato dal calore.

2. Preparazione della camera di osservazione

  1. Con una punta della pipetta, applicare una piccola quantità di grasso siliconico intorno al foro sul lato inferiore della slitta forata (Figura 4D).
  2. Posizionare un coperchio di 24 x 50 mm di spessore 0,13-0,16 mm.
  3. Con l'estremità larga di una punta della pipetta, applicare una pressione sul coperchio per appiattire il silicone al fine di sigillare il coperchio e creare un anello in silicone all'interno della slitta (Figura 4F, G).

3. Dissezione ovaio

  1. Anestetizzare una mosca femmina del fenotipo desiderato su un cuscinetto di CO2.
  2. Trasferire la femmina in 150 μL del mezzo di imaging in un pozzo di dissezione (Figura 4H).
  3. Apri una femmina afferrando il torace con una pinna e pizzicando la cuticola dell'addome dorsale con un secondo paio di pinci.
  4. Isolare e staccare la coppia di ovaie, che dovrebbero essere facilmente visibili all'apertura della cuticola.
  5. Rimuovere con attenzione l'utero, l'ovidotto e la guaiina muscolare (Figura 4I).
  6. Posizionare una goccia di 10-15 μL del mezzo di imaging e trasferire un'ovaia nella camera di imaging (Figura 4J, K).

4. Isolamento della camera delle uova

  1. Per separare gli ovarioli, tenere l'estremità posteriore dell'ovaio (verso gli stadi più vecchi) con l'ago. Stuzzicare gli ovarioli tirando con cura il germario con un altro ago.
  2. Rimuovere la guaina muscolare rimanente sulle camere delle uova; un ago che tiene la guaine e l'altro che tira l'ovariole attraverso le camere più grandi (stadio 9 o più vecchio).
  3. Lasciare affondare l'ovariole non infessato e contattare il coperchio.
  4. Rimuovere le fasi tardive e il resto delle ovaie dalla microcamere con l'aiuto di una pincipe. Distanziare con attenzione gli ovarioli dagli altri con aghi per facilitarne l'acquisizione (Figura 4L).

5. Chiusura della camera di osservazione

  1. Tagliare un piccolo quadrato (10 x 10 mm) di membrana permeabile (Figura 4M,N).
  2. Applicare con attenzione la membrana sulla parte superiore del mezzo di imaging per espellere eventuali bolle d'aria (Figura 4O).
  3. Sigillare ermeticamente la camera con un sottile strato di olio di alocarburi attorno al pozzo sul contorno della membrana (Figura 4P,Q).

6. Imaging

  1. Posizionare il set-up di imaging sul supporto del vetrino del microscopio invertito utilizzando un obiettivo 40x (HCX PL Apo, 1.25NA, immersione in olio).
  2. Individua e salva le posizioni di diversi ovociti di stadio 6 in cui il nucleo è pronto per migrare.
  3. Impostare i laser da 488 e 561 nm. Con una potenza laser in uscita misurata di 150 mW, utilizzare rispettivamente il 30% della potenza del laser e l'esposizione di 300 ms e 500 ms.
  4. Impostare l'esperimento. Prendi un time-lapse di 12 h con l'intervallo di 15 min-41 sezioni con un intervallo di 1 μm centrato sul nucleo.
    NOTA: In base al tempo di esposizione sopra descritto, questa impostazione consente l'acquisizione di una posizione in circa 45 s. Poiché c'è un ritardo dovuto al cambio di posizione, si consiglia di impostare un massimo di 12 posizioni in queste condizioni.

7. Analisi delle immagini

  1. Elabora i filmati sul software Fiji, utilizzando la vista ortogonale del plug-in e traccia manualmente i nuclei.

Sequenza tecnica di microiniezione per l'analisi degli embrioni di Drosophila al microscopio.
Figura 4: Immagini di montaggio amicrocamere passo dopo passo. (A,B,C) Preparazione degli strumenti necessari: sezionare la piastra del pozzo, la pinzetta, gli aghi, i supporti di imaging, il grasso al silicio, la membrana permeabile e il vetrino in alluminio. (D) Applicazione del grasso di silicio sul retro del vetrino di alluminio con punta di pipetta. (E) Una copertura di vetro viene incollata sul grasso di silicio per creare il fondo della camera. (F,G) Applicazione a pressione sul coperchio con l'estremità più ampia della punta di una pipetta per creare un giunto all'interno della camera. (H,I) Dissezione delle ovaie della mosca nei mezzi di imaging. (J) Pipettaggio di una goccia di mezzo di imaging nella microcamera. (K,L) Separazione degli ovarioli nella microcamere mediante aghi. (M,N,O) Membrana permeabile tagliata in un quadrato di 10 x 10 mm e posizionata sopra la goccia del mezzo nella microcamere. (P,Q) Sigillatura della microcamere con olio alocarbonato. I campioni sono pronti per essere ripresi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

Prima della migrazione, il nucleo è dinamico e oscilla attorno a una posizione centrale durante un periodo definito come pre-migrazione. Questi piccoli movimenti riflettono un equilibrio di forze di spinta e trazione che mantengono l'equilibrio nel mezzo dell'ovocita. Quantificando le traiettorie dei nuclei, abbiamo dimostrato che le traiettorie APM e LPM avevano proporzioni simili. Definiamo la natura della traiettoria dal primo contatto tra il nucleo e la membrana plasmatica6. Pertanto, il nucle...

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Discussione

Altri protocolli descrivono come preparare e coltura le camere per uova di Drosophila ex vivo per il saggio di imaging dal vivo12,13. La novità di questo protocollo è l'uso di una camera di imaging costruita utilizzando un vetrino di alluminio cavo, un coverslip e una membrana permeabile A O2/ CO2. Il vantaggio principale di questa configurazione è quello di limitare il movimento in Z senza esercitare pressione sul campione. Pertant...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Siamo estremamente grati a Jean-Antoine Lepesant e Nicolas Tissot che hanno originariamente sviluppato il protocollo e condiviso con noi alcuni elementi grafici della Figura 3. Ringraziamo Fanny Roland-Gosselin che ha scattato le foto della Figura 4. Ringraziamo anche gli altri membri del laboratorio per le discussioni utili che hanno contribuito al miglioramento di questa tecnica e Nathaniel Henneman per i suoi commenti che hanno contribuito a migliorare questo manoscritto. Riconosciamo la struttura principale di ImagoSeine dell'Istituto Jacques Monod, membro di France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh è supportato da una borsa di dottorato del Ministero della Ricerca francese (MESRI). Antoine Guichet e Fred Bernard sono stati sostenuti dall'ARC (Grant PJA20181208148), dall'Association des Entreprises contre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) e da una sovvenzione Emergence dell'IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cuscinetto CO2 per anestesiaDutscher789060Mosche per anestesia
Vetrino coprioggetti (24x50 mm)Knittel GlassVD12450Y100APreparazione della camera di osservazione
Pinze Dumont #5Carl RothK342.1Dissezione
Aghi in acciaio inoxEntosphinx20Dissezione
Siero fetale di vitello inattivato a caldoSIGMA-ALDRICHF7524Terreno di imaging
Soluzione di insulina pancreas bovinoSIGMA-ALDRICH10516 - 5mlTerreno di imaging
di penicilina/streptomicinaSIGMA-ALDRICHP0781Terreno di imaging
Membrana permeabileLeica11521746Preparazione della camera di osservazione
Schneider MediumPan BiotechP04-91500Mezzo di imaging
Grasso al silicioBECKMAN COULTER335148Preparazione della camera di osservazione
Disco rotante confocaleZeissCSU-X1Osservazione della migrazione nucleare
Olio di Voltalef 10SVWR24627 - 188Preparazione della camera di osservazione
Soluzione

Riferimenti

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