Questo protocollo presenta un metodo per la coltura e la crescita 3D di cellule simili agli ameloblasti in microgravità per mantenere la loro forma allungata e polarizzata e l'espressione proteica specifica dello smalto. Sono inoltre descritte le condizioni di coltura per la coltura dei costrutti di ingegneria parodontale e degli organi polmonari in microgravità.
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Articolo metodologico
Propagazione di cellule e organi dentali e respiratori in microgravità
In questo articolo
Sommario
Abstract
La gravità è uno dei determinanti chiave della funzione delle cellule umane, della proliferazione, dell'architettura citoscheletrica e dell'orientamento. I sistemi di bioreattori rotanti (RCCS) imitano la perdita di gravità che si verifica nello spazio e forniscono invece un ambiente di microgravità attraverso la rotazione continua di cellule o tessuti in coltura. Questi RCCS assicurano un apporto ininterrotto di nutrienti, fattori di crescita e trascrizione e ossigeno e affrontano alcune delle carenze delle forze gravitazionali in piatti immobili di coltura cellulare o di organi 2D (bidimensionali). Nel presente studio abbiamo utilizzato RCCS per co-coltivare cellule dell'ansa cervicale e cellule della polpa dentale per diventare ameloblasti, per caratterizzare le interazioni progenitore/scaffold parodontale e per determinare l'effetto dell'infiammazione sugli alveoli polmonari. Gli ambienti RCCS hanno facilitato la crescita di cellule simili agli ameloblasti, promosso la proliferazione dei progenitori parodontali in risposta ai rivestimenti dell'impalcatura e hanno permesso una valutazione degli effetti dei cambiamenti infiammatori sugli alveoli polmonari coltivati. Questo manoscritto riassume le condizioni ambientali, i materiali e le fasi lungo il percorso ed evidenzia aspetti critici e dettagli sperimentali. In conclusione, gli RCCS sono strumenti innovativi per padroneggiare la coltura e la crescita 3D (tridimensionale) di cellule in vitro e per consentire lo studio di sistemi cellulari o interazioni non suscettibili di classici ambienti di coltura 2D.
Introduzione
La gravità influenza tutti gli aspetti della vita sulla Terra, compresa la biologia delle singole cellule e la loro funzione all'interno degli organismi. Le cellule percepiscono la gravità attraverso i meccanorecettori e rispondono ai cambiamenti di gravità riconfigurando le architetture citoscheletriche e alterando la divisione cellulare 1,2,3. Altri effetti della microgravità includono la pressione idrostatica nelle vescicole piene di liquido, la sedimentazione degli organelli e la convezione guidata dalla galleggiabilità del flusso e del calore4. Gl....
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Protocollo
È stata ottenuta tutta l'approvazione istituzionale necessaria per garantire che lo studio fosse conforme alle linee guida istituzionali per la cura degli animali TAMU.
1. Assemblaggio e sterilizzazione del bioreattore
- Sterilizzare quattro recipienti ad alto rapporto d'aspetto (HARV) per il bioreattore in autoclave sul ciclo dello strumento in plastica per 20 minuti a 121 °C come raccomandato dal produttore.
- Dopo la sterilizzazione, assemblare i vasi in una cappa di coltura cellulare stringendo le viti fornite con il bioreattore dopo di che i vasi sono pronti per l'uso.
2. Scaffold utilizz....
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Risultati
La camera interna del bioreattore fornisce un ambiente in cui le cellule possono proliferare e differenziarsi, attaccarsi a un'impalcatura o riunirsi per formare tessuti come assemblaggi. Ogni vaso HARV contiene fino a 10 ml di terreno e facilita una circolazione costante di sostanze nutritive in modo che ogni cellula abbia un'eccellente possibilità di sopravvivere. La figura 1A illustra il fissaggio delle porte della siringa alla piastra anteriore del recipiente in cui sono fissate le valvo.......
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Discussione
I passaggi critici del protocollo per la crescita delle cellule in microgravità includono il bioreattore, lo scaffold, le cellule utilizzate per la coltura 3D e il rivestimento dello scaffold come mezzo per indurre la differenziazione cellulare. Il tipo di bioreattore utilizzato nei nostri studi comprende il bioreattore RCCS-4, una recente modifica dell'originale dispositivo di coltura cilindrica rotante del sistema di coltura cellulare rotante (RCCS) sviluppato dalla NASA per far crescere cellule in microgravità simulat.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Gli studi sono stati generosamente sostenuti da sovvenzioni del National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 e R01-DE027930).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Antibiotico-antimicotico | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Acido ascorbico | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Mezzi di modifica | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST Ponteggio PGA | Synthecon | Custom | Disponibile presso l'azienda tramite un ordine personalizzato |
| BMP-2 | R& D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R& D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Disco di gelatina | Advanced Fogli di | CytoForm 500 | |
| Biomatrix | CytoForm 300 | ||
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Disco di idrossiapatite | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 proteina | PeproTech | 200-06 | |
| Cheratinociti SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 Sequenza | personalizzata: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Membrana in nitrocellulosa | Merck Millipore | ||
| RCCS Bioreattore | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Valvola di sicurezza rubinetto unidirezionale con luer lock maschio girevole | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Siringhe con ago 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Tripsina EDTA (0,25%) | ThermoFisher Scientfic |
Riferimenti
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 ....
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Ristampe e permessi
