Bioprinting 3D di astrociti corticali murini per l'ingegneria del tessuto neurale

Sommario

Qui riportiamo un metodo di bioprinting 3D di astrociti corticali murini per biofabbricare tessuti neurali simili per studiare la funzionalità degli astrociti nel sistema nervoso centrale e i meccanismi che coinvolgono le cellule gliali nelle malattie e nei trattamenti neurologici.

Abstract

Gli astrociti sono cellule gliali con un ruolo essenziale nel sistema nervoso centrale (SNC), compreso il supporto neuronale e la funzionalità. Queste cellule rispondono anche alle lesioni neurali e agiscono per proteggere il tessuto da eventi degenerativi. Gli studi in vitro sulla funzionalità degli astrociti sono importanti per chiarire i meccanismi coinvolti in tali eventi e contribuire allo sviluppo di terapie per il trattamento dei disturbi neurologici. Questo protocollo descrive un metodo per biofabbricare una struttura tissutale simile a quella neurale ricca di astrociti mediante bioink 3D bioprinting carico di astrociti. In questo lavoro è stato utilizzato un bioprinter 3D basato sull'estrusione e gli astrociti sono stati estratti dalle cortecce cerebrali dei cuccioli di topi C57Bl / 6. Il bioink è stato preparato mescolando astrociti corticali fino al passaggio 3 in una soluzione di biomateriale composta da gelatina, gelatina-metacriloile (GelMA) e fibrinogeno, integrata con laminina, che presentava condizioni ottimali di bioprinting. Le condizioni di bioprinting 3D hanno ridotto al minimo lo stress cellulare, contribuendo all'elevata vitalità degli astrociti durante il processo, in cui il 74,08% ± l'1,33% delle cellule erano vitali subito dopo la bioprinting. Dopo 1 settimana di incubazione, la vitalità degli astrociti è aumentata significativamente all'83,54% ± al 3,00%, indicando che il costrutto 3D rappresenta un microambiente adatto per la crescita cellulare. La composizione del biomateriale permetteva l'attaccamento cellulare e stimolava il comportamento astrocitico, con cellule che esprimevano lo specifico marcatore astrocitario della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e possedevano la tipica morfologia astrocitica. Questo protocollo riproducibile fornisce un metodo prezioso per biofabbricare tessuto neurale 3D ricco di astrociti che assomiglia al microambiente nativo delle cellule, utile ai ricercatori che mirano a comprendere la funzionalità degli astrociti e la loro relazione con i meccanismi coinvolti nelle malattie neurologiche.

Introduzione

Gli astrociti sono il tipo di cellula più abbondante nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi cerebrale. Oltre a sopportare il supporto neuronale, gli astrociti sono responsabili della modulazione dell'assorbimento dei neurotrasmettitori, del mantenimento dell'integrità della barriera emato-encefalica e della regolazione della sinaptogenesi neuronale^1,2. Gli astrociti hanno anche un ruolo essenziale nell'infiammazione del SNC, rispondendo alle lesioni al cervello in un processo che porta alla reattività astrologica o all'astrogliosi reattiva^3,

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali hanno seguito le linee guida internazionali per l'uso degli animali nella ricerca (http://www.iclas.org) e sono state approvate dal Comitato per l'etica nella ricerca dell'Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519).

1. Dissezione cerebrale dei topi

1. Trasferire 10 mL di soluzione salina tamponata Hanks (HBSS) fredda in una soluzione di coltura da 100 mm e 1 mL in un microtubo da 1,5 mL. Preparare un microtubo per animale.
   NOTA: Sia il piatto di coltura che il microtubo devono essere tenuti sul ghiaccio.
2. Preparare il terreno di coltura degli astrociti utilizz....

Risultati

Questo lavoro mirava a sviluppare un tessuto simile a quello neurale utilizzando la tecnologia di bioprinting 3D per depositare strato per strato la gelatina primaria carica di astrociti / GelMA / fibrinogen bioink. Gli astrociti sono stati estratti e isolati dalla corteccia cerebrale dei cuccioli di topo (Figura 1), aggiunti a una composizione di biomateriale, consentendo la biofabbricazione di un costrutto 3D vivente.

Il computer-aided-design (CAD) è stato svilu.......

Discussione

La tecnologia di bioprinting 3D è emersa come alternativa alla biofabbricazione che consente l'ingegnerizzazione di costrutti raffinati che strutturalmente e fisiologicamente assomigliano ai tessuti nativi²², incluso il cervello²³. La biofabbricazione di tessuti simili a quelli neurali consente la modellazione in vitro del microambiente nativo, essendo uno strumento importante per comprendere i meccanismi cellulari e molecolari associati allo sviluppo e al trattame.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bioprinter 3D	Soluzioni biotecnologiche		Bioprinter a
punta smussata basata sull'estrusione	Integra Miltex	6--30	Pinze per dissezione cerebrale precedentemente sterilizzate
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Senza proteasi, senza acidi grassi, essenzialmente senza globuline
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Pallone per colture cellulari	Fisher Scientific	156340	Pallone per colture T25
Filtro cellulare	Corning Incorporated	352340	Filtro cellulare 40 µ m
Microscopio confocale	Leica		Microscopia confocale TCS SP8 accoppiata a un sistema confocale Olympus FluoView 300
Provette coniche	Thermo Scientific	339651, 339652	Provette sterili da 15 mL e 50 mL
DAPI	Abcam	ab224589	Soluzione colorante DAPI
DMEM/F12	Gibco; Life Technologies Corporation	12500062	DMEM/F-12 50/50, 1X (Mod. Di Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) con tubo per L-glutammina
Dyalisis	Sigma-Aldrich	D9527	Cut-off del peso molecolare = 14 kDa
Etanolo	Fisher Scientific	64-15-5
Siero fetale bovino	di grado reagente Gibco; Life Technologies Corporation	12657011	grado di ricerca
	Sigma-Aldrich	9001-32-5	Fibrinogeno cristallino in polvere da plasma bovino
Gelatina	Sigma-Aldrich	9000-70-8	Gelatina in polvere da pelle suina
Glicina	Sigma-Aldrich	56-40-6	Glicina in polvere
Hanks Soluzione salina tamponata (HBSS)	Gibco; Life Technologies Corporation	14175095	Senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo
L-Glutammina	Sigma-Aldrich	56-85-9	L-Glutammina polvere cristallina
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Kit di imaging cellulare vivo in kit morto	Thermo Scientific	R37601	Fluorescenza verde in cellule vive (es/em 488 nm/515 nm). Fluorescenza rossa in cellule morte (es/em 570 nm/602 nm)
Anidride metacrilico	Sigma-Aldrich	760-93-0	Per la preparazione di GelMA
Microprovette	Corning Incorporated	MCT-150-C	Microprovette da 1,5 mL
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Ago 22G	Fisher Scientific	NC1362045	Ago smussato sterile
Operativo forbice	Integra Miltex	05--02	Forbice affilata per dissezione cerebrale precedentemente sterilizzata
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Paraformaldeide in polvere
Penicillina/Streptomicina	Gibco; Life Technologies Corporation	15070063	Pen Strep (5.000 unità/mL di penicillina; 5.000 ug/mL di streptomicina)
Piastra di Petri	Corning Incorporated	430591, 430588	Piastre di Petri sterili da 35 e 100 mm
Falloidina	Abcam	ab176753	reagente iFluor 488
Fotoiniziatore	Sigma-Aldrich	106797-53-9	2-idrossi-4′-(2-idrossietossi)-2- metilpropiofenone
, tampone fosfato, soluzione salina (PBS)	Gibco; Life Technologies Corporation	10010023	PBS 1 x, grado di coltura, senza calcio, senza magnesio
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Poli-L-lisina bromidrato mol wt 30.000-70.000
Antocorpo primario	Abcam	ab4674	Policlonale di pollo a GFAP
Anticorpo secondario	Abcam	ab150176	Alexa fluor 594
Spatola	anti-polloMiltex	V973-70	Numero 24 spatola di cemento precedentemente sterilizzata
Stereomicroscopio	Fisherbrand	3000038	Microscopio per dissezione cerebrale
Siringa 5 mL	BD	1222C84	Siringa sterile Siringa
2 & micro; m	Fisher Scientific	09-740-105	Filtro in polipropilene per sterilizzazione
Trombina	Sigma-Aldrich	9002--04-4	Trombina cristallina in polvere da plasma bovino
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tripsina-EDTA	da laboratorio Gibco; Life Technologies Corporation	15400054	Tripsina senza fenolo rosso 1 x diluito in PBS
Versene soluzione	Gibco; Life Technologies Corporation	15040066	soluzione di Versene (0,48 mM) formulata come 0,2 g di EDTA(Na4) per litro di piastra a
pozzetti	Thermo Scientific	144530	Piastra sterile a 24 pozzetti

3D Fibrinogeno di PBS