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Articolo metodologico

Dissezione ovarica planaria per analisi ultrastrutturale e colorazione anticorpale

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DOI:

10.3791/62713

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10 settembre 2021

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1Stowers Institute for Medical Research, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Department of Human Genetics, University of California Los Angeles

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta le misure adottate per sezionare le ovaie nelle planarie d'acqua dolce, Schmidtea mediterranea. Le ovaie sezionate sono compatibili per l'immunocolorazione anticorpale e l'analisi ultrastrutturale con microscopia elettronica a trasmissione per studiare la biologia cellulare degli ovociti e delle cellule somatiche, fornendo una profondità e una qualità di imaging precedentemente inaccessibili.

Abstract

L'accessibilità alle cellule germinali consente lo studio dello sviluppo, della meiosi e della ricombinazione delle cellule germinali. Il biotipo sessuale della planaria d'acqua dolce, Schmidtea mediterranea, è un potente modello di invertebrato per studiare la specificazione epigenetica delle cellule germinali. A differenza del gran numero di cellule germinali testicolari e maschili, gli ovociti planari sono relativamente difficili da localizzare ed esaminare, poiché ci sono solo due ovaie, ciascuna con 5-20 ovociti. La localizzazione più profonda all'interno del corpo planario e la mancanza di tessuti epiteliali protettivi rendono anche difficile sezionare direttamente le ovaie planarie.

Questo protocollo utilizza una breve fase di fissazione per facilitare la localizzazione e la dissezione delle ovaie planarie per l'analisi a valle per superare queste difficoltà. L'ovaio sezionato è compatibile per l'esame ultrastrutturale mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e immunocolorazione anticorpale. La tecnica di dissezione descritta in questo protocollo consente anche esperimenti di perturbazione genica, in cui le ovaie vengono esaminate in diverse condizioni di interferenza dell'RNA (RNAi). L'accesso diretto alle cellule germinali intatte nell'ovaio ottenuto da questo protocollo migliorerà notevolmente la profondità e la qualità dell'imaging e consentirà l'interrogazione cellulare e subcellulare della biologia degli ovociti.

Introduzione

L'anatomia planaria è stata esaminata utilizzando la TEM in molti tessuti 1,2,3,4,5,6. Tuttavia, è stata prestata poca attenzione alle ovaie o agli ovociti. La scarsità di letteratura sugli ovociti è in parte dovuta alla difficoltà di accesso a queste cellule, lasciando la biologia degli ovociti planari in gran parte inesplorata. Gli strumenti molecolari hanno scoperto molti meccanismi di regolazione dello sviluppo ovarico nelle planarie utilizzando la microscopia a luce o a fluorescenza 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 . Tutti questi esperimenti sono stati eseguiti su vermi interi o sezioni istologiche di vermi interi. I protocolli di colorazione degli anticorpi e di ibridazione in situ su vermi interi comportano ampie fasi di sbiancamento, lavaggio e pulizia dei tessuti, che richiedono molto tempo e diversi giorni.

L'obiettivo generale del metodo qui descritto è quello di fornire l'accessibilità alle ovaie e agli ovociti planari intatti e sezionati, il che eliminerà la necessità di sbiancamento o sezionamento istologico e ridurrà il tempo per il lavaggio e la pulizia dei tessuti nella colorazione degli anticorpi e nell'ibridazione in situ. Le ovaie sezionate miglioreranno anche la penetrazione della sonda o degli anticorpi e aumenteranno la profondità e la qualità dell'imaging per i microscopi ottici ed elettronici. L'accessibilità alle ovaie e agli ovociti sezionati consente la ricerca di biologia cellulare a risoluzione cellulare e subcellulare con ovociti interi intatti. Un recente studio su ovaie planarie sezionate ha caratterizzato per la prima volta la meiosi degli ovociti planari con la TEM e la microscopia confocale21. Il lavoro ha fornito una descrizione completa di un nuovo fenomeno durante la meiosi chiamato vescicolazione dell'involucro nucleare.

Qui presentiamo le procedure dettagliate nella dissezione delle ovaie planarie. Una fase di fissazione è stata sufficiente per preservare la struttura cellulare dell'ovaio per la dissezione e la manipolazione a valle (ad esempio, l'elaborazione per l'analisi TEM e al microscopio ottico). Data la loro somiglianza nei piani corporei e nell'architettura dei tessuti, questo protocollo dovrebbe anche essere ampiamente informativo per lo studio degli ovociti e dei loro nuclei in diverse altre specie di Platyhelminthes (ad esempio, il genere Dugesia o Polycelis). Questo protocollo è probabilmente irrilevante per il Macrostomum lignano per le sue piccole dimensioni e l'architettura corporea quasi trasparente, che consentirà l'osservazione diretta dell'ovaio e degli ovociti 22,23,24. L'area del corpo contenente le ovaie è più distinguibile otticamente (ad esempio, pigmentata più scura o pigmentata più chiara) in alcune specie (ad esempio, Dugesia ryukyuensis 9,25) rispetto a S. mediterranea. Gli studi su queste specie possono fare meno affidamento sulle linee guida per localizzare le ovaie in S. mediterranea qui presentate, ma sfruttare le condizioni di fissazione e dissezione.

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Protocollo

1. Preparazione

  1. Prepara i vermi: nutri le planarie sessuali due volte a settimana con pasta di fegato biologica per raggiungere la maturità sessuale.
    NOTA: Generalmente, tali vermi sono più grandi di 1 cm di lunghezza e hanno un gonoporo posteriore all'apertura della faringe.
  2. Prepara le soluzioni.
    1. Preparare i seguenti reagenti: 16% paraformaldeide (PFA); Soluzione acquosa di glutaraldeide (GA) al 50%; N-acetil-L-cisteina (NAC); 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 e 2 mM KH2PO4.
    2. Diluire il 50% di GA e il 16% di PFA con PBS fino a ottenere una miscela finale di 2,5% GA e 2% di PFA. Diluire il 16% di PFA con PBS fino a una concentrazione finale del 4% di PFA.
    3. Sciogliere 5 g di NAC in 100 mL di PBS per ottenere una soluzione di lavoro al 5%.

2. Raccolta delle ovaie

  1. Trattare i vermi sessualmente maturi con il 5% di NAC in un piatto a temperatura ambiente per 5 minuti.
    NOTA: I vermi di grandi dimensioni possono arricciarsi. Per appiattire i vermi è possibile utilizzare spazzole o puntali per pipette. La quantità di NAC al 5% utilizzata è minima, sufficiente a coprire la superficie della capsula di Petri.
  2. Sostituire la NAC con 10 ml di paraformaldeide al 4% appena preparata e fissare i vermi per 1 ora a temperatura ambiente agitando di tanto in tanto. Iniziare la dissezione 10 minuti dopo l'aggiunta del 4% di PFA ed eseguire la dissezione in PFA al 4% mentre i vermi vengono fissati.
  3. Osservare la pigmentazione epiteliale per localizzare le corde nervose ventrali, che appaiono come due linee con una pigmentazione più chiara che va dai gangli cefalici anteriori verso la coda.
  4. Individua le ovaie.
    NOTA: L'ovaio si trova proprio accanto al cordone nervoso sul lato mediale (Figura 1A). Affidarsi alla pigmentazione degli epiteli per localizzare la posizione dell'ovaio in direzione antero-posteriore. Idealmente, la pigmentazione degli epiteli ventrali nella regione ovarica è più chiara rispetto alle regioni circostanti. In alcuni vermi, la pigmentazione degli epiteli ventrali non fornisce sufficiente sicurezza. Questi vermi possono essere scartati in quanto alcuni potrebbero non avere ovaie ben sviluppate.
  5. Convalidare le posizioni delle ovaie una volta che le ovaie putative sono localizzate dalla pigmentazione.
    NOTA: Innanzitutto, le ovaie sono posteriori ai gangli cefalici. In secondo luogo, i testicoli di colore scuro sono laterali alla superficie dorsale sopra l'ovaio. Le ovaie si trovano davanti al testicolo più anteriore (Figura 1B). A volte, i lobi dei testicoli sono posizionati a livello delle ovaie o leggermente anteriormente ad esse.
  6. Utilizzare due coltelli chirurgici per tagliare la parte posteriore e anteriore delle due ovaie (Figura 1C) per rimuovere completamente i frammenti di verme anteriori e posteriori. Usa un coltello per ancorare il verme e pulisci l'altro coltello usato per fare i tagli.
  7. Tagliare la linea mediana del frammento ovarico per separare le due ovaie. Capovolgi il frammento in modo che abbia il lato ventrale rivolto verso il basso.
  8. Staccare il tessuto dorsale per esporre l'intestino (Figura 1D) con due paia di pinzette appuntite (tipo 5-SA).
    NOTA: L'ovaio a forma di cupola si trova sotto i rami dell'intestino.
  9. Rimuovere delicatamente i rami intestinali che si trovano sopra i tessuti ventrali con la punta delle pinzette o una spazzola morbida per esporre l'ovaio (Figura 1E).
  10. Rimuovere i tessuti circostanti per estrarre l'ovaio (Figura 1F, G).
  11. Estrarre le ovaie e trasferirle in una provetta da 1,5 ml per lavarle con 1 ml di PBS.

3. Fissazione per TEM

  1. Lavare le ovaie in PBS per 10 minuti agitando delicatamente. Tieni le tube in posizione verticale e lascia che le ovaie affondino sul fondo per gravità. Ripetere il lavaggio una volta.
    NOTA: Se le ovaie non affondano, applicare una centrifuga delicata per 15 s con una minicentrifuga da banco (velocità massima 2000 × g).
  2. Sostituire il PBS con il 2% di PFA/2,5% di GA/PBS.
  3. Fissare i campioni a temperatura ambiente per 1 ora su un agitatore a 40 giri/min.
  4. Conservare i campioni in fissativo a 4 °C per una notte su un agitatore a 40 giri/min.

4. Elaborazione dei campioni per la TEM

  1. Lavare le ovaie in PBS 3 volte per 10 minuti ciascuna.
  2. Lavare le ovaie in acqua bidistillata (ddH2O) 3 volte per 10 minuti ciascuna.
  3. Post-fissare le ovaie in OsO4 acquoso al 2% per 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
    NOTA: Durante questa fase, i contenitori dei campioni devono essere sigillati con parafilm. Preparare il 2% di OsO4 con acqua trattata ad osmosi inversa (vedere la Tabella dei materiali).
  4. Sciacquare i campioni con ddH2O 3 volte, 10 min ciascuna.
  5. Pre-colorare le ovaie in acetato acquoso di uranile (UA) al 2% per una notte a 4 °C.
    NOTA: La soluzione di UA deve essere filtrata prima dell'uso; Evitare la luce durante la colorazione in blocco . Preparare il 2% di OsO4 con acqua trattata ad osmosi inversa (vedere la Tabella dei materiali).
  6. Sciacquare i campioni in ddH2O 4 volte agitando delicatamente, 10 minuti ciascuna.
  7. Disidratare le ovaie in una serie di etanolo graduato (30%, 50%, 70%, 95% e due volte 100%, 10 minuti ciascuna soluzione) e quindi equilibrarle in due incubazioni (10 minuti) in ossido di propilene.
  8. Per l'infiltrazione con la resina, incubare i campioni in una miscela di 50% ossido di propilene/50% resina epossidica liquida per una notte a 4 °C. Infiltrare i campioni con resina epossidica al 100% con 3 cambi (1 ora ciascuno) con una leggera agitazione.
  9. Incorporare le ovaie in resina epossidica al 100% e polimerizzare la resina a 60 °C per 48 ore.

5. Ultramicrotomia

  1. Rifilatura a blocchi e controllo del campione con un microscopio ottico
    1. Taglia i blocchi campione a forma di piramide con una lama di rasoio.
    2. Tagliare sezioni di 1-2 μm di spessore con un coltello da vetro o diamantato.
    3. Trasferire le sezioni su un vetrino con una goccia d'acqua, quindi riscaldare il vetrino su una piastra calda fino a quando le sezioni non si appiattiscono e aderiscono alla superficie del vetrino durante l'evaporazione dell'acqua.
    4. Coprire le sezioni con una goccia di blu toluidina all'1% O e scaldarle su una piastra calda per ~10 s. Sciacquare lo scivolo con acqua corrente, quindi lasciarlo asciugare. Controllare le sezioni con un normale microscopio ottico.
  2. Taglio, raccolta e post-colorazione di sezioni ultrasottili.
    1. Tagliare sezioni ultrasottili di 50-70 nm di spessore con un coltello diamantato. Trasferire le sezioni dal battello a coltello su reti o griglie di rame a fessura singola.
    2. Colorare le sezioni al 2% di UA per 8 min. Lavare le griglie in corrente ddH2O per 30 s.
    3. Colorare le sezioni con una soluzione di piombo all'1% per 6 minuti. Lavare le sezioni in corrente ddH2O per 1 minuto e asciugarle all'aria.

6. Raccolta e analisi dei dati

  1. Raccogliere i dati GST utilizzando un software appropriato, ad esempio la micrografia digitale (vedere la Tabella dei materiali per maggiori dettagli).
  2. Far funzionare l'oscilloscopio a 80 kV. Inserire la griglia del campione nell'oscilloscopio quando il vuoto è pronto.
  3. Accendi il raggio facendo clic su Luce nel menu. Ruotare la manopola Intensità sul control pad sinistro fino a quando il tempo di esposizione automatica non è ~1 s. Fare clic su Avvia acquisizione per ottenere un'immagine finale.
  4. Costruisci modelli EM tridimensionali utilizzando il pacchetto IMOD (Image Processing, Modeling, and Display) open source.

7. Colorazione degli anticorpi

  1. Lavare le ovaie sezionate (passaggio 2.16) in una provetta per microfuge da 1,5 mL con 1 mL di 1x PBS integrato con Triton X-100 (PBST) allo 0,5%. Posizionare le provette su uno shaker per agitazione a 40 giri/min per 10 minuti. Lascia riposare le provette in una rastrelliera e le ovaie affondano per gravità. Sostituire il lavaggio con PBST fresco e ripetere due volte.
  2. Digerire i tessuti con 2 μg/mL di proteinasi K e dodecilsolfato di sodio allo 0,1% per 10 minuti a temperatura ambiente in PBST.
  3. Lavare le ovaie digerite in PBST tre volte per 10 minuti ogni lavaggio.
  4. Incubare le ovaie con siero di cavallo al 10% in PBST per 1 ora a temperatura ambiente.
  5. Diluire gli anticorpi primari da 1 a 100 nella soluzione bloccante (10% di siero di cavallo in PBS con 0,5% di Triton X-100). Incubare le ovaie con gli anticorpi primari per una notte a 4 °C agitando delicatamente.
  6. Lavare le ovaie in PBST tre volte per 10 minuti ogni lavaggio.
  7. Incubare le ovaie con anticorpi secondari per una notte a 4 °C agitando delicatamente. Diluire tutti gli anticorpi secondari 1:300 nella soluzione bloccante.
  8. Lavare le ovaie in PBST tre volte, assicurandosi che il primo e il terzo lavaggio durino 10 minuti. Colorare i nuclei ovarici con Hoechst 33342 alla diluizione 1:300 in PBST per 30 minuti a temperatura ambiente nel secondo lavaggio.
  9. Montare le ovaie sui vetrini.
    NOTA: Il montante anti-sbiadimento può essere utilizzato per prolungare i segnali di fluorescenza.

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Risultati

Il metodo qui presentato è stato descritto da Guo et al.21. La chiave per una dissezione di successo è identificare la pigmentazione ovarica e posizionare correttamente le guide. La strategia del metodo è quella di passare da posizioni ampie a una posizione specifica. Innanzitutto, per raggiungere questo obiettivo, fare affidamento sui modelli di pigmentazione dorsale e ventrale (Figura 1A, B). La pigmentazione ventrale, dove risiedono le ovaie, diven...

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Discussione

Queste procedure basate sulla fissazione per la dissezione delle ovaie planarie faciliteranno la comprensione della meiosi degli ovociti, nonché dello sviluppo e della rigenerazione delle ovaie. Le dimensioni degli ovociti e delle loro cellule somatiche di supporto possono variare da 20 μm a 50 μm. I metodi basati sulla dissezione forniranno l'accessibilità alle cellule ovariche singole intatte che il sezionamento o i metodi basati sul montaggio intero non possono ottenere. Questo protoc...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Il lavoro è stato sostenuto dall'Howard Hughes Medical Institute (LK e ASA) e dalla Helen Hay Whitney Foundation (LHG).

I dati originali alla base di questo manoscritto sono accessibili dallo Stowers Original Data Repository all'indirizzo http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
16% paraformaldeide Scienzedella microscopia elettronica15710
microscopia elettronicaOsO4 acquosa2% 19152
Scienze della microscopia elettronicaglutaraldeide al 50%16320
Micrografia digitaleGatan Inc.Versione 2.33.97.1, raccolta dati TEM
resina EponMicroscopia elettronica Scienze14120Embed 812 Kit, liquido, resina epossidica
EtanoloTed Pella19207Denaturato
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Siero di cavalloSigmaH1138
Microscopia elettronica con acetato di piomboScienze
MilliQ acquatrattata con osmosi inversa
N-acetil-L-cisteinaSigmaA7250
ParafilmsigmaP7793
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36965
Ossido di propileneMicroscopia elettronicaScienze 75569Grado EM
  Proteinasi KThermo Fisher Scientific25530049
Blu di toluidina O Microscopiaelettronica Scienze92319
Microscopio elettronico a trasmissioneFEITecnai G2 Spirit BioTWIN
Acetato di uranileMicroscopia elettronicaScienze 541093
Scienze della di grado EM della di grado EM 6080564

Riferimenti

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