Raccolta dei tessuti ed estrazione dell'RNA dall'articolazione del ginocchio osteoartritico umano

Sommario

I tessuti primari ottenuti da pazienti dopo artroplastica totale del ginocchio forniscono un modello sperimentale per la ricerca sull'osteoartrite con la massima traducibilità clinica. Questo protocollo descrive come identificare, elaborare e isolare l'RNA da sette tessuti del ginocchio unici per supportare l'indagine meccanicistica nell'osteoartrite umana.

Abstract

L'osteoartrite (OA) è una malattia articolare cronica e degenerativa che colpisce più spesso il ginocchio. Poiché attualmente non esiste una cura, l'artroplastica totale del ginocchio (TKA) è un intervento chirurgico comune. Esperimenti che utilizzano tessuti OA umani primari ottenuti da TKA forniscono la capacità di studiare i meccanismi della malattia ex vivo. Mentre in precedenza si pensava che l'OA impattasse principalmente sulla cartilagine, ora è noto che ha un impatto su più tessuti nell'articolazione. Questo protocollo descrive la selezione del paziente, l'elaborazione dei campioni, l'omogeneizzazione dei tessuti, l'estrazione dell'RNA e il controllo di qualità (basato sulla purezza, l'integrità e la resa dell'RNA) da ciascuno dei sette tessuti unici per supportare l'indagine del meccanismo della malattia nell'articolazione del ginocchio. Con il consenso informato, i campioni sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a TKA per OA. I tessuti sono stati sezionati, lavati e conservati entro 4 ore dall'intervento chirurgico mediante congelamento flash per la fissazione dell'RNA o della formalina per l'istologia. I tessuti raccolti includevano cartilagine articolare, osso subcondrale, menisco, cuscinetto di grasso infrapatellare, legamento crociato anteriore, sinovia e muscolo obliquo vastus medialis. I protocolli di estrazione dell'RNA sono stati testati per ogni tipo di tessuto. La modifica più significativa ha coinvolto il metodo di disintegrazione utilizzato per i tessuti duri a bassa cellula, ad alta matrice (considerati come cartilagine, ossa e menisco) rispetto ai tessuti molli relativamente ad alta cellula, a bassa matrice (considerati come cuscinetto di grasso, legamento, sinovia e muscolo). Si è scoperto che la polverizzazione era appropriata per i tessuti duri e l'omogeneizzazione era appropriata per i tessuti molli. È stata osservata una propensione per alcuni soggetti a produrre valori più elevati di numero di integrità dell'RNA (RIN) rispetto ad altri soggetti in modo coerente su più tessuti, suggerendo che fattori sottostanti come la gravità della malattia possono influire sulla qualità dell'RNA. La capacità di isolare RNA di alta qualità dai tessuti OA umani primari fornisce un modello fisiologicamente rilevante per sofisticati esperimenti di espressione genica, incluso il sequenziamento, che possono portare a intuizioni cliniche che sono più facilmente tradotte per i pazienti.

Introduzione

Il ginocchio è la più grande articolazione sinoviale del corpo umano, comprendente l'articolazione tibiofemorale tra la tibia e il femore e l'articolazione femoro-rotula tra la rotula e il femore¹. Le ossa del ginocchio sono rivestite con cartilagine articolare e supportate da vari tessuti connettivi, tra cui menischi, grasso, legamenti e muscoli, e una membrana sinoviale incapsula l'intera articolazione per creare una cavità piena di liquido sinoviale^1,2,3 ( Figura1). Un ginocchio sano funziona come un'articolazione a cer....

Protocollo

Questo protocollo di studio è stato approvato e ha seguito le linee guida istituzionali stabilite dall'Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB #13995).

1. Selezione del paziente

1. Identificare i pazienti tra quelli programmati per sottoporsi a TKA con un chirurgo ortopedico.
2. Selezionare i pazienti in base ai criteri di ammissibilità definiti dal protocollo di studio. Esempi di criteri di inclusione includono avere almeno 18 anni di età e avere una diagnosi confermata di osteoartrosi del ginocchio. Esempi di criteri di esclusione includono la sostituzione parziale del ginocchio o una diagnosi confermata di ....

Risultati

Sette tessuti unici dell'articolazione del ginocchio umano sono disponibili per la raccolta da pazienti sottoposti a TKA per OA (Figura 1). In questo protocollo, ciascuno di questi tessuti è stato identificato ed elaborato entro 4 ore dalla rimozione chirurgica (Figura 2). Seguendo i passaggi descritti nella Figura 3,porzioni di ciascun tessuto sono state fissate in formalina per la valutazione istologica (Figur.......

Discussione

Il protocollo presentato si è dimostrato efficace per la raccolta di sette tessuti OA umani primari per l'estrazione dell'RNA (Tabella 1) e l'elaborazione istologica (Figura 4). Prima di raccogliere i campioni dei pazienti, è necessario stabilire un protocollo approvato dall'IRB, idealmente in collaborazione con un chirurgo o un team chirurgico. L'applicazione di un protocollo standardizzato per la raccolta dei campioni (ad esempio, la resezione da posizioni coerenti in .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Eppendorf	05 402	Sterile, senza nucleasi. Riservato solo al lavoro sull'RNA.
10% Formalina	Cardinal Health	C4320-101	Conservare nell'armadio chimico quando non in uso.
100% cloroformio (grado di biologia molecolare)	Fisher Scientific	ICN19400290	sterile, privo di nucleasi. Riservato solo al lavoro con l'RNA, conservare nell'armadio chimico quando non viene utilizzato.
100% etanolo (grado di biologia molecolare)	Fisher Scientific	BP2818500	sterile, privo di nucleasi. Riservato solo al lavoro sull'RNA, durante la diluizione utilizzare acqua priva di DEPC/nucleasi.
100% isopropanolo (grado di biologia molecolare)	Fisher Scientific	AC327272500	sterile, privo di nucleasi. Riservato solo al lavoro con l'RNA, conservare nell'armadio chimico quando non viene utilizzato.
Alcool reagente al 100%	Cardinal Health	C4305	diluito al 70% con dH2O per scopi di pulizia.
Piastre di coltura sterili da 15 cm	Thermo Scientific	12-556-003	Sterili, prive di nucleasi.
Provette da 15 mL in polipropilene (Falcon)	Fisher Scientific	14 959 53A	Sterili, prive di nucleasi.
2 mL crioviali (filettati esternamente)	Fisher Scientific	10 500 26	Sterile, senza nucleasi.
Provette a fondo tondo da 5 mL	Corning	352052	sterili, prive di nucleasi. Riservato solo al lavoro sull'RNA.
Provette da 50 mL in polipropilene (Falcon)	Fisher Scientific	12 565 271	Sterili, prive di nucleasi.
Bioanalizzatore	Agilent	G2939BA	Per la misurazione dell'integrità dell'RNA.
Armadio di biosicurezza Attrezzature			generali di laboratorio
Tagliaossa	Fisher Scientific	08 990	Sterilizzato con il 70% di EtOH.
Cappa chimica Attrezzature			generali di laboratorio
Bisturi monouso (n. 10)	Thermo Scientific	3120032	Sterile, privo di nucleasi.
EDTA	Life Technologies	15-576-028	Soluzione al 10% con dH2O.
Pinze	Qualsiasi fornitore		Sterilizzato con il 70% di EtOH.
Glicoblu Coprecipitante	Fisher Scientific	AM9516	Riservato solo per il lavoro sull'RNA, conservare a -20 °C.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Azoto liquido	Qualsiasi fornitore
Azoto liquido Dewar	Attrezzature
Mortaio e pestello	Qualsiasi fornitore		Riservato solo per il lavoro sull'RNA, sterilizzato secondo il protocollo.
Spettrofotometro Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000	Per misure di purezza e resa dell'RNA.
Acqua priva di nucleasi/trattata con DEPC	Fisher Scientific		Sterile, priva di nucleasi. Riservato solo al lavoro sull'RNA.
PBS (Sterile)	Gibco	20 012 050	Sterile, senza nucleasi.
Pipette (2 µ L, 20 & micro; L, 200 & micro; L, 1000 & micro; L) & suggerimenti	Qualsiasi fornitore		Sterile, senza nucleasi.
Kit miRNA avanzato/plasma/siero	Qiagen	217204
Centrifuga refrigerata 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	Thermo Scientific	50 197 8158	Sterile, senza nucleasi.
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
Spatola (dimensioni semimicro)	Qualsiasi fornitore		Riservato solo per il lavoro sull'RNA.
Omogeneizzatore tissutale	Pro Scientific	01-01200	Riservato solo per il lavoro sull'RNA, sterilizzato secondo il protocollo.
Reagente TRIzol	Fisher Scientific	15 596 026	Sterile, senza nucleasi. Riservato solo al lavoro sull'RNA.

di laboratorio generali