Studi di interazioni Chaperone-Cochaperone utilizzando il saggio omogeneo basato su perle

Summary

Questo protocollo presenta una tecnica per sondare le interazioni proteina-proteina utilizzando perle donatrici legate al glutatione con co-chaperoni tPR fusi GST e perle accettori accoppiate con un peptide derivato da Hsp90. Abbiamo usato questa tecnica per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.

Abstract

Il targeting delle interazioni con la proteina 90 (Hsp90)-cochaperone offre la possibilità di regolare specificamente i processi intracellulari Hsp90-dipendenti. Il pentapeptide MEEVD conservato al C-terminus di Hsp90 è responsabile dell'interazione con il motivo della ripetizione tetratricopeptidica (TPR) dei co-chaperoni. La proteina legante FK506 (FKBP) 51 e FKBP52 sono due co-chaperoni simili con motivo TPR coinvolti in malattie steroidee ormono-dipendenti con funzioni diverse. Pertanto, l'identificazione di molecole che bloccano specificamente le interazioni tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52 fornisce un potenziale terapeutico promettente per diverse malattie umane. Qui, descriviamo il protocollo per un saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato per sondare le interazioni tra Hsp90 e i suoi co-accompagnatori partner FKBP51 e FKBP52. In primo luogo, abbiamo purificato le proteine contenenti il motivo TPR FKBP51 e FKBP52 in forma di glutatione S-transferasi (GST). Utilizzando le perle donatrici legate al glutatione con proteine TPR-motif fuse GST e le perle accettori accoppiate con un peptide C-terminale 10 mer di Hsp90, abbiamo sondato le interazioni proteina-proteina in un ambiente omogeneo. Abbiamo utilizzato questo test per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.

Introduction

Gli chaperoni molecolari contribuiscono all'omeostasi delle proteine, compreso il ripiegamento, il trasporto e la degradazione delle proteine. Regolano diversi processi cellulari e sono legati a numerose malattie come il cancro e le malattie neurodegenerative¹. Heat shock protein 90 (Hsp90) è uno dei più importanti chaperoni la cui funzione dipende dai cambiamenti conformazionali guidati dall'idrolisi dell'ATP e dal legame con le proteine client mediate dai suoi co-chaperoni². Nonostante un evidente potenziale di Hsp90 come bersaglio terapeutico, la messa a punto della sua funzione rappresenta una grande sfida. Esistono diversi inibitori di Hsp90 che prendono di mira la regione di legame con l'ATP N-terminale, che sono stati valutati in studi clinici, ma nessuno di essi è stato approvato per la^{commercializzazione 3}. A causa della mancanza di una tasca legante ben^{definita 4}, mirata alla regione C-terminale di Hsp90 ha avuto un successo limitato⁴. Recentemente, l'interruzione delle interazioni Hsp90-cochaperone da parte di piccole molecole è stata studiata come strategia alternativa⁵. Il targeting delle interazioni Hsp90-cochaperone non susciterebbe una risposta generale allo stress cellulare e offre la possibilità di regolare specificamente vari processi intracellulari. Il pentapeptide MEEVD conservato al C-terminus di Hsp90 è responsabile dell'interazione con il motivo della ripetizione tetratricopeptidica (TPR) dei co-chaperoni⁶. Delle 736 proteine contenenti motivi TPR annotate nel database delle proteine umane, ~ 20 diverse proteine interagiscono con Hsp90 tramite questo peptide⁷. Le molecole che competono per il legame peptidico MEEVD interromperebbero le interazioni tra Hsp90 e co-chaperoni contenenti un dominio TPR. Il sito di legame peptidico ha una struttura terziaria simile, ma l'omologia complessiva tra diversi domini del motivo TPR è relativamente bassa⁷, fornendo l'opportunità di identificare molecole specificamente in grado di bloccare le interazioni tra Hsp90 e particolari co-chaperoni del motivo TPR. Tra questi co-chaperoni del motivo TPR, la proteina legante FK506 (FKBP) 51 e FKBP52 sono regolatori della segnalazione del recettore dell'ormone steroideo (SHR) e coinvolti in diverse malattie steroidee ormono-dipendenti tra cui cancro, malattie legate allo stress, malattie metaboliche e morbo di Alzheimer⁸. Sebbene FKBP51 e FKBP52 condividano > somiglianza di sequenza dell'80%, le loro funzioni differiscono: FKBP52 è un regolatore positivo dell'attività SHR, mentre FKBP51 è un regolatore negativo nella maggior parte dei casi⁸. Pertanto, l'identificazione delle molecole, bloccando in particolare le interazioni tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52, fornisce un potenziale terapeutico promettente per le malattie correlate.

Unsaggio Luminescente Pomogeno A(AlphaScreen) è stato sviluppato per la prima volta nel 1994 da Ullman EF et al.⁹. Ora è ampiamente usato per rilevare diversi tipi di interazioni biologiche, come il peptide¹⁰, la proteina¹¹, il DNA¹², l'RNA¹³e lo zucchero¹⁴. In questa tecnica, ci sono due tipi di perle (diametro 200 nm), una è la perle donatrice e l'altra è la perle accettore. Le biomolecole sono immobilizzate su queste perle; le loro interazioni biologiche portano le perle del donatore e dell'accettore nelle vicinanze. A 680 nm, un fotosensibilizzatore nel cordone donatore illumina e converte l'ossigeno in ossigeno singoletto. Poiché l'ossigeno singoletto ha una vita breve, può diffondersi solo fino a 200 nm. Se il perle accettore è in prossimità, il suo derivato tiosseno reagisce con l'ossigeno singoletto generando chemiluminescenza a 370 nm. Questa energia attiva ulteriormente i fluorofori nello stesso perle accettore per emettere luce a 520-620 nm¹⁵. Se le interazioni biologiche vengono interrotte, il perno accettore e il perno donatore non possono raggiungere la vicinanza, con conseguente decadimento dell'ossigeno singoletto e segnale basso prodotto.

Qui descriviamo un protocollo che utilizza questa tecnica per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni tra co-chaperoni Hsp90 e TPR, in particolare FKBP51 e FKBP52. I 10 peptidi lunghi di amminoacidi corrispondenti a Hsp90 estremo C-terminus sono attaccati a perline accettori. I co-chaperoni TPR purificati con tag GST interagiscono con le perle di donatore legate al glutatione. Quando l'interazione tra peptidi derivati da Hsp90 e co-chaperoni del motivo TPR riunisce le perle, viene prodotto un segnale amplificato (Figura 1A). Se le piccole molecole schermate possono inibire le interazioni tra Hsp90 e co-chaperoni del motivo TPR, questo segnale amplificato sarà diminuito (Figura 1B). Il loro IC₅₀ può essere calcolato mediante misurazione quantitativa. Questo protocollo può essere esteso a qualsiasi interazione di co-chaperone chaperone chaperone - TPR-motif ed è di grande importanza nello sviluppo di nuove molecole, bloccando in particolare l'interazione tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52.

Figura 1: Il principio di base di questo saggio. (A) GST-FKBP51 purificato interagisce con le perle donatrici legate al glutatione. I 10 peptidi lunghi di amminoacidi corrispondenti all'estremo C-terminus di Hsp90 sono attaccati alle perle accettori. L'interazione tra i peptidi derivati da Hsp90 e il dominio TPR di FKBP51 porta le perle del donatore e dell'accettore in prossimità. A 680 nm, un fotosensibilizzatore nel cordone donatore illumina e converte l'ossigeno in ossigeno singoletto. Il derivato tiossene sul perle accettore reagisce con l'ossigeno singoletto e genera chemiluminescenza a 370 nm. Questa energia attiva ulteriormente i fluorofori nello stesso perle accettore per emettere luce a 520-620 nm. (B) Quando piccole molecole inibiscono le interazioni tra Hsp90 e FKBP51, le perle del donatore e dell'accettore non possono raggiungere la prossimità. Quindi l'ossigeno singoletto con breve durata decade e non viene prodotto alcun segnale rilevabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

NOTA: una panoramica di questo protocollo è illustrata nella Figura 2.

1. Espressione e purificazione di GST-FKBP51 e GST-FKBP52 (Figura 2A)

1. Plasmidi
   NOTA: Ottenere cDNA cloni per FKBP51 umano (id clone: 5723416) e per FKBP52 umano (id clone: 7474554) dal consorzio IMAGE.
   1. Amplificare il DNA umano FKBP51 mediante PCR con primer (in avanti; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', inverso; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') contenenti sporgenze BamHI e XhoI e clonare in vettore pGEX6-1 nei siti di restrizione BamHI / XhoI.
   2. Amplificare il DNA umano FKBP52 mediante PCR con primer (in avanti; 5'-GAATTCATGAGAGCCGAGGAGATG-3', inverso; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') contenenti sporgenze EcoRI e XhoI e clonare in vettore pGEX6-2 nei siti di restrizione EcoRI / XhoI.
      NOTA: Impostazione e condizioni della reazione PCR sono mostrate nella Tabella 1 e nella Tabella 2.
   3. Verificare la sequenza inserita e trasformare i plasmidi nell'E. coli chimicamente competente secondo il protocollo di fabbricazione.
2. Espressione e purificazione delle proteine
   1. Aggiungere 25 g di base di brodo di Luria (LB) in 1 L di acqua distillata per produrre la soluzione LB. Autoclave a 121 °C per 15 min. Dopo il raffreddamento, aggiungere 50 μg/mL di ampicillina.
   2. Prendere una colonia di batteri che esprimono GST-FKBP51 o GST-FKBP52 e mescolare con 500 μL di soluzione LB in un tubo da 1,5 ml. Vortice.
   3. Aggiungere la miscela di "1.2.2" in 1 L di soluzione LB nel matraccio Erlenmeyer coperto con un foglio di alluminio. Incubare il matraccio Erlenmeyer nello shaker durante la notte a 37 °C.
   4. Indurre l'espressione proteica aggiungendo 1 mM di isopropil-β-D-tiogalattoside (IPTG) al matraccio di Erlenmeyer e continuare l'incubazione per altre 2 ore.
   5. Per ottenere pellet di cella, centrifugare a 5.000 x g per 15 minuti. Rimuovere il surnatante.
      NOTA: Il pellet cellulare può essere conservato a -20 °C.
   6. Riaspendare i pellet di cella in 40 ml di PBS e sonicare 3 x 20 s sul ghiaccio. Aggiungere 1 mM PMSF, 1 mM EDTA e cocktail inibitore della proteasi (1 compressa) per prevenire la proteolisi.
   7. Centrifugare la sospensione per 30 min 50.000 x g per rimuovere i detriti cellulari e applicare il surnatante su una colonna GST-trap da 5 ml.
   8. Dopo aver lavato la colonna con 30 mL PBS, elute GST-FKBP51 e GST-FKBP52 con 5 mL di glutatione 10 mM in PBS.
   9. Concentrare le proteine su un'unità di centrifugazione da 15 mL 10.000 MWCO. Per rimuovere il glutatione libero, passare i concentrati attraverso la colonna PD-10 bilanciata con PBS 0,5x e concentrarsi nuovamente sul dispositivo di centrifuga filtrante.
   10. Raccogliere frazioni contenenti proteine. Verificare le proteine in SDS-PAGE e regolare le concentrazioni proteiche a 1 mg/ml.
       NOTA: La resa proteica tipica è di 2-5 mg/L di coltura. La proteina può essere immagazzinata a -20 °C.

2. Accoppiamento del peptide C-terminale Hsp90 alle perle accettori (Figura 2B)

1. Preparazione del peptide Hsp90
   1. Sintetizzare dieci peptidi aminoacidi NH₂-EDASRMEEVD-COOH corrispondenti agli amminoacidi 714-724 dell'isoforma Hsp90 beta umana (UniProt ID: P08238) mediante un servizio di sintesi peptidica.
   2. Diluire il peptide Hsp90 in PBS alla concentrazione di 1 mg/mL.
2. Preparazione per perle accettori
   1. Diluire le perle accettori non coniugate in PBS a 1 mg/mL di concentrazione e trasferirle in un tubo da 1,5 mL.
   2. Eseguire il lavaggio per centrifugazione a 16.000 x g per 15 min. Rimuovere con attenzione il surnatante.
3. Coniugazione
   1. Impostare il rapporto tra pere e peptide come 10:1. Nel tubo da 1,5 mL contenente 1 mg di pellet di perle accettore (preparato come descritto sopra), aggiungere 1 mL di PBS (pH 7,4), 0,1 mg di peptide diluito, 1,25 μL di Tween-20, 10 μL di una soluzione da 400 mM di cianoboroidrato di sodio (NaBH₃CN) in acqua.
      ATTENZIONE: NaBH3CN è tossico; utilizzare un cappuccio e guanti per fumi. La_soluzionenaBH 3 CN deve essere preparata al momento.
   2. Incubare per 24 ore a 37 °C con agitazione end-over-end (10-20 rpm) su uno shaker rotativo.
4. Tempra di reazione e lavaggio delle pere
   1. Aggiungere 20 μL di soluzione 1 M Tris-HCl (pH 8,0) alla reazione per bloccare i siti non reazionati. Incubare per 1 ora a 37 °C.
   2. Centrifugare a 16.000 x g (o velocità massima) per 15 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risuspenare il pellet di perle in 1 mL di soluzione di Tris-HCl (100 mM, pH 8,0).
   3. Ripetere la fase di lavaggio tre volte.
   4. Dopo l'ultima centrifugazione, riconsegrega le perle a 1 mg/mL nel tampone di conservazione (1 mL di 0,5 × PBS con 0,01% di azide di sodio come conservante). Conservare la soluzione di perle accettore coniugate a 4 °C protetta dalla luce.
      ATTENZIONE: l'azide di sodio è tossico; utilizzare un cappuccio e guanti per fumi.

3. Il test che sonda l'interazione tra GST-FKBP51 o GST-FKBP52 e il peptide C-terminale Hsp90 e l'inibizione con composti di piccola massa molecolare (Figura 2C)

1. Proteine marcate con GST che interagiscono con le perine donatrici di glutatione
   1. Impostare le reazioni in piastre a 384 pozzi.
   2. Preparare la soluzione contenente 10 μg/mL di perle donatrici di glutatione in 0,5x PBS, pH 7,4.
      NOTA: Dopo una conservazione prolungata, le perine si depositano e devono essere vorticose.
   3. Aggiungere GST-FKBP51 o GST-FKBP52 a una concentrazione finale di 10 μg/mL.
   4. Incubare al buio a 25 °C per 10 min.
      NOTA: In questa fase, le proteine con tag GST interagiranno con il glutatione attaccato alle perine. Per ogni pozzo verranno utilizzati 22,5 μL di questa miscela. La concentrazione dei partner vincolanti deve essere determinata empiricamente. Titolare GST-FKBP51 e GST-FKBP52 e scegliere la concentrazione che dà il segnale migliore.
2. Aggiunta composta
   1. Effettuare diluizioni seriali di composti di prova in DMSO.
      NOTA: le concentrazioni utilizzate sono in genere 10, 30, 100, 300, 1.000 e 3.000 μM.
   2. Aggiungere 0,25 μL di DMSO (controllo negativo) o peptide C-terminale Hsp90 (controllo positivo, 30 μM) o composti in DMSO all'angolo di ciascun pozzettino della piastra. Utilizzare triplicati per ogni concentrazione di composti.
   3. Aggiungere 22,5 μL della soluzione contenente perle donatrici di glutatione con proteine marcate GST a ciascun pozzo.
   4. Agitare delicatamente il piatto con la mano ma accuratamente. Incubare al buio a 25 °C per 15 min.
      NOTA: Durante questo periodo, i composti interagiranno con il dominio TPR nel sito di legame peptidico C-terminale Hsp90.
3. Aggiunta di perle accettori
   1. Diluire le perle accettori con peptide C-terminale Hsp90 collegato a 100 μg/mL in 0,5x PBS.
   2. Aggiungere 2,25 μL di perle accettori diluite a ciascun pozzo.
   3. Mescolare delicatamente ma accuratamente. Incubare al buio a 25 °C per 15 min.
      NOTA: In questa fase, le perle del donatore e dell'accettore vengono portate in prossimità dalle interazioni proteina-peptide. Il volume finale della miscela di reazione è di 25 μL. Pertanto, le concentrazioni finali di composti vanno da 0,1 a 30 μM.
4. Lettura targhe
   NOTA: Leggere la piastra utilizzando un lettore di piastre impostato nella modalità pertinente.
   1. Accendi lo strumento e apri il software
   2. Scegli il protocollo pertinente.
   3. Fare clic su Modifica mappa piastra e selezionare il benessere utilizzato nella piastra per la misurazione.
   4. Fare clic su Avanti per continuare ed eseguire il protocollo selezionato.
   5. Dopo la misurazione, fare clic su Mostra risultati per visualizzare i risultati.
   6. Esportare i dati.

4. Analisi dei dati

1. Fattore Z' e rapporto segnale-sfondo (S/B)
   1. Calcolare il fattore Z' e il rapporto S/B per il saggio utilizzando la seguente equazione:
      Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│¹⁶
      S/B=μneg/pos μ
      dove, σ e μ rappresentano le deviazioni standard e le medie dei controlli positivi (peptide C-terminale Hsp90, 30 μM) e negativi (DMSO), rispettivamente. Un fattore Z > 0,5 assicurerà che il test sia abbastanza robusto per lo screening. Per monitorare la sensibilità del test, è stato calcolato anche il rapporto S/B.
2. Curva dose-risposta e IC ₅₀
   NOTA: utilizzare l'analisi di regressione non lineare per adattare i dati degli inibitori PPI di Hsp90-cochaperones tramite software.
   1. Creare una tabella dati XY nella finestra di dialogo Benvenuto e selezionare NumeriX e Immetti Y 3 (se triplicato) replicare i valori in colonne affiancate.
   2. Normalizzare i dati del segnale dei campioni al gruppo di controllo negativo. Importare i valori di concentrazione nella colonna X e i valori del segnale nella colonna Y.
   3. Fare clic su Analizza e scegliere Trasforma concentrazione (X) in Trasforma | Normalizza. Selezionate Trasforma in logaritmi.
      NOTA: questo trasformerà la concentrazione in una scala di log. Se la tua concentrazione iniziale è zero, impostala su un numero molto piccolo che è effettivamente zero (ad esempio, 0,1 nM) per non perdere quei valori poiché il logaritmo di zero non è definito.
   4. Fare clic su Analizza e scegliere Regressione non lineare (adattamento della curva) in Analisi XY, aprire Dose-Risposta-Inibizione e scegliere Log(inibitore) vs. risposta -- Pendenza variabile.
   5. Fare clic su OK per visualizzare i risultati (contenenti il valore IC₅₀₎ e i grafici.

Figura 2: Schema di questo protocollo. (A) Espressione e purificazione di GST-FKBP51 e GST-FKBP52. (B) Accoppiamento del peptide C-terminale Hsp90 alle perle accettori. (C) Il saggio che sonda l'interazione tra GST-FKBP51 o GST-FKBP52 e il peptide C-terminale Hsp90. Inibizione con composti di piccola massa molecolare. Creato con BioRender.com Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Results

Nel nostro test, il fattore Z e il rapporto S/B sono rispettivamente 0,82 e 13,35 (Figura 3A), dimostrando che il nostro test è robusto e affidabile per lo screening ad alto rendimento. L'abbiamo quindi usato per lo screening di piccoli composti di massa molecolare. La Figura 3B presenta l'inibizione dose-dipendente delle interazioni chaperone-cochaperone con una piccola molecola selezionata (D10). Le curve dose-risposta per D10 sono generate dall'analisi di reg...

Discussion

Qui descriviamo un protocollo che utilizza il test per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni tra I co-chaperoni Hsp90 e TPR, in particolare FKBP51 e FKBP52. Il suo punteggio Z' elevato (>0,8) dimostra la robustezza e l'affidabilità per un formato ad alto throughput. I risultati possono essere ottenuti entro un'ora e sono necessarie piccole quantità di perle, proteine e composti. Inoltre, questo protocollo potrebbe essere facilmente esteso a qualsiasi interazione di co-chaperone Hsp90/Hsp70 - TPR-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastre a 384 pozzetti,	Perkin Elmer	6008350	Volume del saggio: 25 ml
Unità di centrifugazione Amicon 10.000 MWCO,	Millipore	UFC901008	Proteina concentrata
: Ampicillina	Sigma	A0166	Antibiotici,
Agitatore batterico, Unimax 1010	Heidolph		Coltura di batteri
, cloni di cDNA per l'uomo, FKBP51	Fonte: BioScience	ID clone: 5723416	cloni di cDNA vettoriali pCMV-SPORT6
per l'uomo FKBP52	Fonte BioScience	ID clone: 7474554	vettore pCMV-SPORT6
Chimicamente competente E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Software di analisi dati	GraphPad Prism	9.0.0	Analisi dei dati e creazione di figure
Software di analisi dei dati	Excel		Dati di analisi
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Composti
diluiti DPBS	Gibco	14190-144	Preparare la soluzione
EDTA	Calbiochem	344504	Prevenire la proteolisi durante la sonicazione
Glutatione	Sigma	G-4251	Eluire le proteine marcate con GST
Perline donatrici	Perkin Elmer	6765300	Perlina
Colonna trappola GST	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purifica le proteine marcate con GST
Isopropil-beta;-D-tiogalattoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce l'espressione proteica
LB Brodo (Miller)	Sigma	L3522	per mezzo di crescita microbica
	BIO-RAD	Colonna S1000 Thermal Cycler	Amplificazione/PCR
PD-10	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Scambio di soluzioni
pGEX-6P-1 vettoriale	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmide
pGEX-6P-2 vettore	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Lettore di piastre plasmidi
	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Leggi alfa piastra
per lettore di piastre	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Software per la lettura di piastre
Protocollo software per la lettura di piastre	Perkin Elmer	Alpha 384-well Basso volume	Utilizzare questo protocollo per leggere la piastra
PMSF	Sigma	P7626	Prevenire la proteolisi durante la sonicazione
cocktail di inibitori della proteasi	Sigma	S8830	Prevenire la proteolisi durante la sonicazione
Sodio azide	Sigma	S2002	Come conservante
Cianoboroidruro di sodio (NaBH3CN)	Sigma	156159	Attiva la matrice per l'accoppiamento
Dieci peptidi di aminoacidi NH2-EDASRMEEVD-COOH corrispondente agli aminoacidi 714-724 dell'isoforma umana Hsp90 beta	Peptide 2.0 inc		Sintetizzare il peptide C-terminale Hsp90
Rotatore in provetta	LABINCO		Effettuare l'agitazione end-over-end
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Bloccare i siti non reagiti delle perle accettori
Tween-20	Sigma	P1379	Prevenire l'aggregazione delle perle
Ultra centrifuga Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuga per ottenere pellet di cellule batteriche
Disgregatore cellulare ad ultrasuoni	Microson		Sonicare le cellule per rilasciare proteine
	Perkin Elmer	6762003	Accettore perline
XCell SureLock Mini-Cell e XCell II Blot	Module Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE