Articolo metodologico
Questo protocollo presenta una tecnica per sondare le interazioni proteina-proteina utilizzando perle donatrici legate al glutatione con co-chaperoni tPR fusi GST e perle accettori accoppiate con un peptide derivato da Hsp90. Abbiamo usato questa tecnica per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.
Il targeting delle interazioni con la proteina 90 (Hsp90)-cochaperone offre la possibilità di regolare specificamente i processi intracellulari Hsp90-dipendenti. Il pentapeptide MEEVD conservato al C-terminus di Hsp90 è responsabile dell'interazione con il motivo della ripetizione tetratricopeptidica (TPR) dei co-chaperoni. La proteina legante FK506 (FKBP) 51 e FKBP52 sono due co-chaperoni simili con motivo TPR coinvolti in malattie steroidee ormono-dipendenti con funzioni diverse. Pertanto, l'identificazione di molecole che bloccano specificamente le interazioni tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52 fornisce un potenziale terapeutico promettente per diverse malattie umane. Qui, descriviamo il protocollo per un saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato per sondare le interazioni tra Hsp90 e i suoi co-accompagnatori partner FKBP51 e FKBP52. In primo luogo, abbiamo purificato le proteine contenenti il motivo TPR FKBP51 e FKBP52 in forma di glutatione S-transferasi (GST). Utilizzando le perle donatrici legate al glutatione con proteine TPR-motif fuse GST e le perle accettori accoppiate con un peptide C-terminale 10 mer di Hsp90, abbiamo sondato le interazioni proteina-proteina in un ambiente omogeneo. Abbiamo utilizzato questo test per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.
Gli chaperoni molecolari contribuiscono all'omeostasi delle proteine, compreso il ripiegamento, il trasporto e la degradazione delle proteine. Regolano diversi processi cellulari e sono legati a numerose malattie come il cancro e le malattie neurodegenerative1. Heat shock protein 90 (Hsp90) è uno dei più importanti chaperoni la cui funzione dipende dai cambiamenti conformazionali guidati dall'idrolisi dell'ATP e dal legame con le proteine client mediate dai suoi co-chaperoni2. Nonostante un evidente potenziale di Hsp90 come bersaglio terapeutico, la messa a punto della sua funzione rappresenta una grande sfida. Esistono ....
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NOTA: una panoramica di questo protocollo è illustrata nella Figura 2.
1. Espressione e purificazione di GST-FKBP51 e GST-FKBP52 (Figura 2A)
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Nel nostro test, il fattore Z e il rapporto S/B sono rispettivamente 0,82 e 13,35 (Figura 3A), dimostrando che il nostro test è robusto e affidabile per lo screening ad alto rendimento. L'abbiamo quindi usato per lo screening di piccoli composti di massa molecolare. La Figura 3B presenta l'inibizione dose-dipendente delle interazioni chaperone-cochaperone con una piccola molecola selezionata (D10). Le curve dose-risposta per D10 sono generate dall'analisi di reg.......
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Qui descriviamo un protocollo che utilizza il test per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni tra I co-chaperoni Hsp90 e TPR, in particolare FKBP51 e FKBP52. Il suo punteggio Z' elevato (>0,8) dimostra la robustezza e l'affidabilità per un formato ad alto throughput. I risultati possono essere ottenuti entro un'ora e sono necessarie piccole quantità di perle, proteine e composti. Inoltre, questo protocollo potrebbe essere facilmente esteso a qualsiasi interazione di co-chaperone Hsp90/Hsp70 - TPR-.......
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Gli autori non segnalano conflitti di interesse.
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio svedese della ricerca (2018-02843), Brain Foundation (Fo 2019-0140), Foundation for Geriatric Diseases presso Karolinska Institutet, Gunvor and Josef Anérs Foundation, Magnus Bergvalls Foundation, Gun and Bertil Stohnes Foundation, Tore Nilssons Foundation for medical research, Margaretha af Ugglas foundation e Foundation for Old Servants.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre a 384 pozzetti, | Perkin Elmer | 6008350 | Volume del saggio: 25 ml |
| Unità di centrifugazione Amicon 10.000 MWCO, | Millipore | UFC901008 | Proteina concentrata |
| : Ampicillina | Sigma | A0166 | Antibiotici, |
| Agitatore batterico, Unimax 1010 | Heidolph | Coltura di batteri | |
| , cloni di cDNA per l'uomo, FKBP51 | Fonte: BioScience | ID clone: 5723416 | cloni di cDNA vettoriali pCMV-SPORT6 |
| per l'uomo FKBP52 | Fonte BioScience | ID clone: 7474554 | vettore pCMV-SPORT6 |
| Chimicamente competente E. coli | Invitrogen | C602003 | One Shot BL21 Star (DE3) |
| Software di analisi dati | GraphPad Prism | 9.0.0 | Analisi dei dati e creazione di figure |
| Software di analisi dei dati | Excel | Dati di analisi | |
| DMSO | Supelco | 1.02952.1000 | Composti |
| diluiti DPBS | Gibco | 14190-144 | Preparare la soluzione |
| EDTA | Calbiochem | 344504 | Prevenire la proteolisi durante la sonicazione |
| Glutatione | Sigma | G-4251 | Eluire le proteine marcate con GST |
| Perline donatrici | Perkin Elmer | 6765300 | Perlina |
| Colonna trappola GST | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | Purifica le proteine marcate con GST |
| Isopropil-beta;-D-tiogalattoside | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Induce l'espressione proteica |
| LB Brodo (Miller) | Sigma | L3522 | per mezzo di crescita microbica |
| BIO-RAD | Colonna S1000 Thermal Cycler | Amplificazione/PCR | |
| PD-10 | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | Scambio di soluzioni |
| pGEX-6P-1 vettoriale | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | Plasmide |
| pGEX-6P-2 vettore | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | Lettore di piastre plasmidi |
| Perkin Elmer | EnSpire 2300 Multilabel Reader | Leggi alfa piastra | |
| per lettore di piastre | Perkin Elmer | EnSpire Manager | Software per la lettura di piastre |
| Protocollo software per la lettura di piastre | Perkin Elmer | Alpha 384-well Basso volume | Utilizzare questo protocollo per leggere la piastra |
| PMSF | Sigma | P7626 | Prevenire la proteolisi durante la sonicazione |
| cocktail di inibitori della proteasi | Sigma | S8830 | Prevenire la proteolisi durante la sonicazione |
| Sodio azide | Sigma | S2002 | Come conservante |
| Cianoboroidruro di sodio (NaBH3CN) | Sigma | 156159 | Attiva la matrice per l'accoppiamento |
| Dieci peptidi di aminoacidi NH2-EDASRMEEVD-COOH corrispondente agli aminoacidi 714-724 dell'isoforma umana Hsp90 beta | Peptide 2.0 inc | Sintetizzare il peptide C-terminale Hsp90 | |
| Rotatore in provetta | LABINCO | Effettuare l'agitazione end-over-end | |
| Tris-HCl | Sigma | 10708976001 | Bloccare i siti non reagiti delle perle accettori |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | Prevenire l'aggregazione delle perle |
| Ultra centrifuga Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | Centrifuga per ottenere pellet di cellule batteriche | |
| Disgregatore cellulare ad ultrasuoni | Microson | Sonicare le cellule per rilasciare proteine | |
| Perkin Elmer | 6762003 | Accettore perline | |
| XCell SureLock Mini-Cell e XCell II Blot | Module Invitrogen | EI0002 | SDS-PAGE |
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