Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni a temperature fino a 70 °C, prima del congelamento a immersione per esperimenti crio-EM.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le griglie di campioni per esperimenti di crio-microscopia elettronica (crio-EM) sono solitamente preparate ad una temperatura ottimale per la conservazione di campioni biologici, per lo più a 4 °C e occasionalmente a temperatura ambiente. Recentemente, abbiamo scoperto che la struttura proteica risolta a bassa temperatura potrebbe non essere funzionalmente rilevante, in particolare per le proteine degli archei termofili. È stata sviluppata una procedura per preparare campioni proteici a temperature più elevate (fino a 70 °C) per l'analisi crio-EM. Abbiamo dimostrato che le strutture provenienti da campioni preparati a temperature più elevate sono funzionalmente rilevanti e dipendenti dalla temperatura. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni ad alta temperatura, usando 55 °C come esempio. L'esperimento si è avvalso di un apparecchio di vetrificazione modificato mediante una provetta da centrifuga supplementare e i campioni sono stati incubati a 55 °C. Le procedure dettagliate sono state messe a punto per ridurre al minimo la condensa del vapore e ottenere un sottile strato di ghiaccio sulla griglia. Vengono forniti esempi di esperimenti riusciti e falliti.
Introduzione
La tecnologia crio-EM per risolvere le strutture dei complessi proteici ha continuato a migliorare, in particolare nella direzione di ottenere strutture ad alta risoluzione 1,2. Nel frattempo, anche il panorama della sua applicazione è stato ampliato variando le condizioni del campione come pH o leganti prima del processo di vetrificazione3, che prevede la preparazione di griglie di campionamento seguite dal congelamento a tuffo 4,5. Un'altra condizione importante è la temperatura. Sebbene gli esperimenti crio-EM, come la crista....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: Questo protocollo mira ad utilizzare un apparato di vetrificazione commerciale modificato per preparare i campioni di microscopia crioelettronica (crio-EM) a temperature specifiche, in particolare superiori a 37 °C. La configurazione sperimentale complessiva è mostrata nella Figura 1. Il protocollo utilizza 55 °C come esempio. Per le condizioni specifiche ad altre temperature, fare riferimento alla tabella supplementare 2 nel riferimento12.
1. Preparazione dell'apparecchio di vetrificazione
- Fare un foro di 1 cm in un tubo di centrifuga da 50 ml sulla sua estremità chiusa....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La panoramica del basso ingrandimento è mostrata nella Figura 5A,B. Il pannello A è un esempio di griglia di successo. C'è un gradiente di ghiaccio dall'alto a sinistra (più spesso) al basso a destra (più sottile o vuoto). Tale griglia rende più facile trovare uno spessore appropriato dello strato di ghiaccio nell'area centrale adatto alla raccolta dei dati, come le caselle blu e verdi. La griglia B è troppo asciutta. I quadrati nella griglia hanno un contrasto luminoso, il .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Nella fase 1 del protocollo, assicurarsi che il tubo della centrifuga sia stato installato bene e non cada quando l'esperimento è in corso. A causa dell'accumulo di un gran numero di goccioline d'acqua nella camera, che potrebbero modificare la capacità di adsorbimento della carta da filtro, si raccomanda che il tempo complessivo dell'esperimento non superi i 30 minuti dopo che la camera dell'apparato di vetrificazione ha raggiunto la temperatura di equilibrio. Se il tempo di funzionamento supera i 30 minuti, l'operatore.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. Hervé Remigy di Thermo Fisher Scientific per gli utili consigli. Gli esperimenti crio-EM sono stati eseguiti presso l'Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM è sostenuto da Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) e Taiwan Protein Project (sovvenzione n. AS-KPQ-109-TPP2). Gli autori ringraziano anche la signora Hui-Ju Huang per l'assistenza nella preparazione del campione.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Falcon provetta Falcon | 352070 | formato: 50 mL | |
| Carta filtro | Ted Pella | 47000-100 | Ø 55/20mm, grado 595 |
| HI1210 | Leica | d'acqua | |
| K100X | Microscopia elettronica Scienze | scarica a bagliore | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu griglia | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | imaging a basso dosaggio |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Pinzetta | Ted Pella | 47000-500 |
Riferimenti
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
