Articolo metodologico

Analisi quantitativa del tasso di crescita di Aspergillus nidulans utilizzando la microscopia dal vivo e il software open source

DOI:

10.3791/62778

⸱

24 luglio 2021

 ,  ,  , 
1Microbial Molecular Genetics Laboratory, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD), 2Light Microscopy Unit, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD)

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo di imaging live senza etichette che utilizza tecniche di microscopia ottica trasmessa per catturare immagini, analizzare e quantificare la cinetica di crescita del fungo filamentoso A. nidulans sia in colture sommerse che in mezzi solidi. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con la microscopia a fluorescenza.

Abstract

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È ben noto che la crescita delle colonie di funghi filamentosi, per lo più dipendente dai cambiamenti nel tasso di crescita apicale di ife/micelio, è stimata macroscopicamente su mezzi solidificati confrontando le dimensioni della colonia. Tuttavia, misurare quantitativamente il tasso di crescita di ceppi o ceppi fungini geneticamente diversi in diverse condizioni ambientali / di crescita (pH, temperatura, fonti di carbonio e azoto, antibiotici, ecc.) è impegnativo. Pertanto, la ricerca di approcci complementari per quantificare la cinetica di crescita diventa obbligatoria al fine di comprendere meglio la crescita delle cellule fungine. Inoltre, è ben noto che i funghi filamentosi, tra cui Aspergillus spp., hanno modalità distinte di crescita e differenziazione in condizioni sub-aeree su mezzi solidi o colture sommerse. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo microscopico quantitativo per analizzare la cinetica di crescita del fungo modello Aspergillus nidulans, utilizzando l'imaging dal vivo sia in colture sommerse che in mezzi solidi. Catturiamo immagini, analizziamo e quantifichiamo i tassi di crescita di diversi ceppi fungini in modo riproducibile e affidabile utilizzando un software gratuito open source per bio-immagini (ad esempio, Fiji), in un modo che non richiede alcuna precedente esperienza di analisi delle immagini da parte dell'utente.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I funghi filamentosi sono di grande importanza socioeconomica ed ecologica, essendo sia cruciali come strumenti industriali / agricoli per la produzione di enzimi e antibiotici1,2 e come agenti patogeni delle piante coltivate3,insetti parassiti4 e umani3. Inoltre, i funghi filamentosi come Aspergillus nidulans sono ampiamente utilizzati come organismi modello per la ricerca fondamentale, come studi in genetica, biologia cellulare ed evolutiva, nonché per lo studio dell'estensione ifale5. I funghi filamentosi sono organismi altamente polarizzati che si allungano attraverso l'apporto continuo di lipidi/proteine di membrana e la sintesi de novo della parete cellulare alla punta estensente6. Un ruolo centrale nella crescita della punta ifale e nel mantenimento della polarità è una struttura specializzata chiamata 'Spitzenkorper' (SPK), una struttura altamente ordinata costituita principalmente da componenti citoscheletriche e dalla distribuzione polarizzata del Golgi6,7,8.

Stimoli /segnali ambientali, come l'interfaccia acqua-aria, la luce, la concentrazione di CO2 e lo stato nutrizionale sono responsabili delle decisioni di sviluppo prese da queste muffe9. Nelle colture sommerse (liquide) la differenziazione di A. nidulans è repressa e la crescita avviene per allungamento della punta ifale6. Durante la crescita vegetativa, le spore asessuate (conidi) germinano per estensione apicale, formando una rete indifferenziata di cellule ifali interconnesse, il micelio, che può continuare a crescere indefinitamente finché i nutrienti e lo spazio sono disponibili. D'altra parte, sui mezzi solidi le punte ifali si allungano e dopo un periodo definito di crescita vegetativa (competenza evolutiva), viene avviata la riproduzione asessuata e i gambi conidiofori aerei si estendono da cellule del piede specializzate del micelio6. Questi danno origine a strutture multicellulari di sviluppo specializzate chiamate conidiofori, che producono lunghe catene di conidiaploidi 10 che possono riavviare la crescita in condizioni ambientali favorevoli.

Un metodo ampiamente utilizzato per misurare la crescita fungina filamentosa è quello di inoculare le spore sull'agar nutriente contenuto in una capsula di Petri e misurare macroscopicamente il diametro della colonia pochi giorni dopo11. Il diametro/area della colonia, più dipendente dalle variazioni del tasso di crescita miceliale e meno dalla densità conidioforica12,viene quindi utilizzato come valore di crescita. Sebbene la misurazione delle dimensioni della popolazione fungina (colonia) che cresce su superfici solide sia abbastanza adeguata, non è affatto la misura più accurata della crescita. Rispetto alle medie del livello di popolazione (medie delle dimensioni delle colonie fungine), le misurazioni delle singole cellule possono catturare l'eterogeneità di una popolazione cellulare e consentire l'identificazione di nuove sotto-popolazioni di cellule, stati13, dinamiche,percorsi e i meccanismi biologici con cui le cellule rispondono ai cambiamenti endogeni e ambientali14,15. Il monitoraggio della crescita e del fenotipo delle cellule fungine mediante microscopia time-lapse è probabilmente l'approccio quantitativo di osservazione a singola cellula più ampiamente utilizzato.

Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo di imaging dal vivo privo di etichette che utilizza tecniche di microscopia ottica trasmessa (come contrasto di fase, contrasto di interferenza differenziale (DIC) e microscopia polarizzata) per acquisire immagini, che indipendentemente dall'uso combinato della microscopia a fluorescenza possono essere utilizzate per analizzare e quantificare la crescita polare dei ceppi di A. nidulans sia in colture sommerse che in mezzi solidi.

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Protocollo

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1. Preparazione dell'inoculo

NOTA: tutti i passaggi devono essere eseguiti in un armadio a flusso laminare.

  1. Strisciare il ceppo fungino di interesse, da un ceppo di glicerolo (-80 °C) utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, su piastre di mezzi minimi (MM) integrate con i requisiti nutrizionali appropriati relativi al ceppo esaminato [MM: 10,0 g/L di glucosio, 20 mL/L di soluzione salina (soluzione salina: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4, 2,0 mL/L cloroformio) e 1 mL/L oligoelementi (oligoelementi: 40 mg/L Na2B4O7· H2O, 400 mg/L CuSO4, 8 g/L ZnSO4, 800 mg/L MnSO4, 800 mg/L FePO4), regolare il pH a 6,8 con 1 M NaOH, aggiungere l'1 % (p/v) di agar e gli integratori necessari come descritto in16 e autoclave] (Figura 1).
    NOTA: La soluzione salina, la soluzione di oligoelementi e gli integratori sono autoclavati.
  2. Incubare per 2-3 giorni a 37 °C.
  3. Utilizzare uno stuzzicadenti sterile (o un anello di inoculazione), trasferire un piccolo numero di conidi, toccando delicatamente una singola colonia, in piastre di mezzi completi (CM) [CM: 10,0 g / L di glucosio, 2,0 g / L di peptone, 1,0 g / L di estratto di lievito, 1,0 g / L di acidi casamino, 20 mL / L soluzione salina, 1 mL / L oligoelementi, 5 mL / L soluzione vitaminica (soluzione vitaminica: 0,1 g/L riboflavina, 0,1 g/L nicotinamide, 0,01 g/L p-ammino-acido benzoico, 0,05 g/L piridossina HCl, 1,0 mg/L biotina), regolare il pH a 6,8 con 1 M NaOH, aggiungere l'1 % (p/v) di agar e gli integratori necessari come descritto in16 e autoclave]. Autoclave e conservare la soluzione vitaminica in un flacone scuro a 4 °C.
    NOTA: Nel caso in cui la crescita fungina sia troppo densa per identificare e isolare le singole colonie, ri-strisciare su una nuova piastra di agar per ottenere singole colonie.
  4. Incubare per 3-4 giorni a 37 °C.
  5. Ottenere una sospensione conidiale di circa 2 x 106 cellule/mL grattando 1 cm dalla superficie di una colonia fungina conidiata cresciuta su piastre di agar CM, utilizzando uno stuzzicadenti sterile (Figura S1).
    NOTA: Quando necessario, contare i conidi con un emocitometro.
  6. Raccogliere conidi di A. nidulans in un tubo centrifugo sterile da 1,5 mL con 1,0 mL di acqua distillata autoclavata contenente lo 0,05% (v/v) Tween 80 per ridurre il numero di ciuffi di conidi.
    NOTA: Conidia può essere conservato fino a 2-3 settimane a 4 °C senza una rilevante perdita di vitalità (A. Athanasopoulos e V. Sophianopoulou, dati non pubblicati). Tuttavia, si raccomanda di filtrare e/o lavare la sospensione conidiale per rimuovere le parti miceliali e le sostanze nutritive, al fine di prevenire il gonfiore conidiale.

2. Preparazione per l'imaging di funghi filamentosi che crescono su mezzi agar (solidi)

NOTA: viene utilizzata una versione modificata del metodo17,18 dell'agar invertito.

  1. Inizialmente, individuare aliquote di 10 μL di conidiale vigorosamente vorticoso (circa 2 x 104 cellule/mL) in più punti su piastre di Petri (Ø9 cm) 15 mL di MM con 1% (p/v) di agar (Figura 2).
    NOTA: Utilizzando la versione modificata del "metodo dell'agar invertito", è possibile eseguire l'immagine di campioni fungini per molte ore senza apparenti effetti deleteri sulla crescita delle ife.
  2. Incubare la coltura sperimentale secondo lo stadio di sviluppo che si intende indagare.
  3. Tagliare un blocco di agar ≈ 0,8 mm2 contenente la colonia usando un bisturi sterile.
    NOTA: Le dimensioni del blocco di agar da tagliare dipendono dalle dimensioni dell'apparecchiatura da posizionare successivamente. Nel presente lavoro vengono utilizzate 8 diapositive ben μ (vedi sotto).
  4. Invertire e posizionare il blocco di agar in un pozzettino di un μ-slide o simile a 8 camere con coperchio con coperchio adatto per l'imaging dal vivo.
    NOTA: Nel caso in cui la microscopia ottica trasmessa venga utilizzata in combinazione con la microscopia a fluorescenza (etichettatura), il blocco di agar può essere invertito su una goccia di mezzo liquido contenente il colorante colorante colorante per cellule vive, appena prima dell'imaging.

3. Preparazione per l'imaging di funghi filamentosi che crescono su terreno liquido

  1. Trasferire aliquote di 10 μL di una sospensione conidiale vigorosamente vorticosa (circa 2 x 104 cellule/mL) nei pozzeli di un 8 pozzedi μ-vetrino contenente 200 μL di MM (liquido) con gli appositi integratori (vedi sopra).
  2. Incubare per il tempo desiderato alla temperatura desiderata (Figura 3).
    NOTA: Se la microscopia a luce trasmessa verrà utilizzata in combinazione con la microscopia a fluorescenza (etichettatura), le colture liquide hanno il grande vantaggio che i coloranti fluorescenti possono essere aggiunti in qualsiasi punto temporale desiderato durante l'esperimento19.

4. Cattura immagini

NOTA: La scelta del microscopio dipende dall'attrezzatura disponibile. In ogni caso la configurazione del microscopio dovrebbe includere uno stadio invertito, una camera ambientale o almeno una stanza con un controllo preciso della temperatura dell'aria.

  1. Preriscaldare la camera del microscopio termostatato a 37 °C (se non diversamente indicato o come adatto alle specie fungine utilizzate) per stabilizzare la temperatura prima dell'inizio. Questa camera consente la modulazione della temperatura dell'ottica del microscopio e dello stadio del campione durante gli esperimenti time-lapse. Tenere presente che le aberrazioni ottiche20 vengono introdotte quando gli oli per immersione normale (progettati per l'uso a 23 °C) vengono utilizzati oli a 37 °C o superiori.
    NOTA: con un budget limitato, le camere di incubazione possono essere realizzate in cartone e materiale di imballaggio isolante21 o utilizzando una stampante 3D22.
  2. Accendere il microscopio, l'alimentazione dello scanner, l'alimentazione del laser e il computer e caricare il software di imaging. Posizionare il μ-vetrino (preparato in precedenza) nella fase del microscopio e mettere a fuoco.
  3. Trova campi di vista che contengono celle isolate / non sovrapposte (o almeno non sovraffollate), al fine di facilitare le misurazioni della crescita durante l'analisi delle immagini. Cattura almeno 50 cellule in crescita per campione per consentire una solida analisi statistica.
  4. Selezionare l'approccio al microscopio ottico trasmesso desiderato. Ridurre il tempo di esposizione o la potenza del laser e il tempo di permanenza dei pixel e/o aumentare i diametri dei fori stenopeici, al fine di ridurre al minimo la fotosciviazione delle cellule fungine, come descritto altrove 23,24.
  5. Impostare il microscopio per acquisire immagini agli intervalli di tempo desiderati e avviare l'acquisizione di serie temporali.
    NOTA: per correggere la deriva focale nel tempo (specialmente per esperimenti lunghi), a causa della deriva termica, delle diverse dimensioni delle cellule e del movimento cellulare, utilizzare una strategia di messa a fuoco automatica, se disponibile nel software del microscopio.

5. Analisi delle immagini

NOTA: questa sezione descrive i passaggi chiave dell'elaborazione di immagini al microscopio time-lapse per misurare il tasso di crescita di A. nidulans. L'apertura, la visualizzazione e l'elaborazione delle immagini viene eseguita con il software open source ImageJ / Fiji25.

  1. Importa le immagini nelle Figi usando Plugins | Bio-Formati | Bio-Formats Importer dal menu Fiji con impostazioni predefinite (Figura 4A).
    NOTA: verificare se l'importatore di bio-formati riconosce correttamente la calibrazione dell'immagine. La dimensione dell'immagine mostrata nella finestra dell'immagine del campo informazioni superiore deve essere uguale alle dimensioni dell'immagine originale (Figura 4B). Premere Maiusc + P per visualizzare e modificare le proprietà dell'immagine nel software ImageJ/Fiji.
  2. Se necessario, utilizzare la corrispondenza dell'istogramma26 per la correzione dell'illuminazione tra fotogrammi diversi (Image | Regolare | | di correzione della candeggina Istogramma Corrispondente) (Figura 4C).
  3. Dove necessario, utilizzare l'algoritmo SIFT (Plugins | | di registrazione Allineamento lineare dello stack con SIFT) per allineare o abbinare le pile di immagini (Figura 4D). La selezione di "Traduzione" dal menu di trasformazione prevista dovrebbe essere sufficiente per correggere qualsiasi deriva x-y.
    NOTA: altri plugin possono essere utilizzati anche per allineare una pila di sezioni di immagine, come Image Stabilizer (https://imagej.net/Image_Stabilizer) o StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).
  4. Seleziona le ife che crescono parallelamente al coverslip, evitando quelle inclinate. Assicurati di selezionare le ife che si propagano per estensione polare ed evita che le ife presentino ramificazioni laterali e/o apicali.
  5. Usa MTrackJ (Plugins | MTrackJ) plugin per tenere traccia delle punte ifali in crescita (Figura 4E)27. Per aggiungere una traccia, selezionate il pulsante Aggiungi nella barra degli strumenti e posizionate il primo punto in una punta ifale con il tasto sinistro del mouse. La serie temporale passerà automaticamente al fotogramma successivo. Per completare il processo di tracciamento, fare doppio clic con il mouse sul punto finale (o premere il tasto Esc) (Figura 4F). Spostati in un altro punto di interesse (ad esempio, la punta ifale in crescita) nel periodo di tempo iniziale e riavvia la procedura misurando il tasso di crescita di un'altra ifa.
    NOTA: per installare MTrackJ seguire le istruzioni presentate in https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
  6. Fare clic sul pulsante Misura nella finestra di dialogo MTrackJ (Figura 4G) per aprire la tabella di output. Salva le misurazioni delle tracce (File | Salva connome ) nel formato di file desiderato (ad esempio, csv), analizzali e tracciali (Figura 4H).
    NOTA: selezionando il pulsante Filmato, viene prodotto un filmato che mostra l'immagine e tiene traccia dei progressi.

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Risultati

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Seguendo questo protocollo, abbiamo catturato e analizzato varie immagini corrispondenti a diversi stadi di crescita / sviluppo del fungo filamentoso A. nidulans. I dati presentati in questo studio sono stati elaborati e analizzati utilizzando il software Fiji. Le misurazioni sono state salvate come file csv, analizzate statisticamente e preparate come grafici utilizzando software statistici commerciali e / o linguaggio di programmazione Python utilizzando librerie software come pandas, numpy, statsmodels, matpl...

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Discussione

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Il monitoraggio della crescita e del fenotipo delle cellule fungine mediante microscopia time-lapse è un approccio potente per valutare il comportamento cellulare in tempo reale e quantitativamente e determinare con precisione se un particolare trattamento farmacologico e / o intervento genetico si traduce in una crescita cellulare rilevabile o differenze fenotipiche nel tempo.

In questo studio, è stata descritta una metodologia affidabile di imaging a cellule vive per misurare e analizzare qu...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal progetto "A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) che è implementato nell'ambito dell'azione "Rafforzamento dell'infrastruttura di ricerca e innovazione", finanziato dal programma operativo "Competitività, imprenditorialità e innovazione" (NSRF 2014-2020) e cofinanziato dalla Grecia e dall'UE.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
µ-Vetrino 8 pozzettiIbidi80826Vetrini per imaging
4-acido amminobenzoicoMerckA9878
azhAΔ ngnAΔGenotipo: zhAΔ::p yrGAf; ngnAΔ::p yrGAf; pyroA4 pantoB100 / Riferimenti:Collezione di laboratorio, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino AcidiGibco223030
BiotinaMerckB4639
CloroformioMerck67-66-3
Solfato di rame (II) pentaidratoMerckC8027
GlucosioMerckG8270
GraphPad Prism 8.0Software GraphPadSoftware statistico
ImageJNIHSoftware di elaborazione e analisi delle immagini
Anello di inoculazioneMerckI8263-500EA
Ferro (III) fosfatoMerck1.03935
Leica Application Suite XLeica MicrosystemsSoftware per microscopio
Solfato di magnesio eptaidratoMerck63138
Solfato di manganese (II) monoidratoMerckM7899
Microscopio Leica TCS SP8Leica Microsystems
Nicotinamide (Niacinamide)Supelco47865-U
PeptoneMillipore68971
Piastre di Petri per Colture MicrobiologiciKISKERG090
Cloruro di potassioMerckP4504
Fosfato di potassio monobasicoMerckP5655
Piridossina cloridratoMerckP6280
Quali - Provette per microcentrifuga, 1,7 mL, senza DNasi, RNasi e pirogeni, steriliKISKERG052-S
Quali - Provette per microcentrifuga, 2,0 mL, steriliKISKERG053-S
Quali - Puntali standard, smussati, 100-1000 &; LKISKERVL004G
Quali - Punte Standard, Smussate, 1-200 &; LKISKERVL700G
Punte per microvolumi, senza DNasi, RNasi, 0,1-10 &; L/chiaroKISKERGC. SUGGERIMENTI. B
Riboflavina (B2)Supelco47861
Lame per bisturi NO. 11OdontoMed2011S2771
Cloruro di sodioMerckS7653
Idrossido di sodioMerckS8045
Tetraborato di sodio decaidratoMerckS9640
VS151 (PilA-GFP e H1-mRFP)Genotipo: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / Riferimenti:Collezione di laboratorio, Biratsi et al., 2021
WTGenotipo: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4; pyrG89 / Riferimenti: TN02A3 -FGSC A1149
Estratto di lievitoMillipore70161
ZnSO4

Riferimenti

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