Analisi dell'espettorato a qualità controllata mediante citometria a flusso

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula e la successiva caratterizzazione di sottoinsiemi cellulari su piattaforme citometriche a flusso standard.

Abstract

L'espettorato, ampiamente utilizzato per studiare il contenuto cellulare e altre caratteristiche microambientali per comprendere la salute del polmone, viene tradizionalmente analizzato utilizzando metodologie basate sulla citologia. La sua utilità è limitata perché la lettura delle diapositive richiede molto tempo e richiede personale altamente specializzato. Inoltre, detriti estesi e la presenza di troppe cellule epiteliali squamose (VEC), o cellule della guancia, spesso rendono un campione inadeguato per la diagnosi. Al contrario, la citometria a flusso consente la fenotipizzazione ad alto rendimento delle popolazioni cellulari escludendo contemporaneamente detriti e SEC.

Il protocollo qui presentato descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula, colorare anticorpi e fissare popolazioni cellulari e acquisire campioni su una piattaforma citometrica a flusso. Una strategia di gating che descrive l'esclusione di detriti, cellule morte (compresi i SEC) e doppietti cellulari è presentata qui. Inoltre, questo lavoro spiega anche come analizzare le cellule vitali e singole dell'espettorato basate su un gruppo di differenziazione (CD)45 popolazioni positive e negative per caratterizzare i sottoinsiemi di lignaggio ematopoietico ed epiteliale. Una misura di controllo della qualità viene fornita anche identificando macrofagi polmonari specifici come prova che un campione è derivato dal polmone e non è saliva. Infine, è stato dimostrato che questo metodo può essere applicato a diverse piattaforme citometriche fornendo profili espettorati dello stesso paziente analizzati su tre citometri a flusso; Navios EX, LSR II e Lyric. Inoltre, questo protocollo può essere modificato per includere ulteriori marcatori cellulari di interesse. Qui viene presentato un metodo per analizzare un intero campione di espettorato su una piattaforma citometrica a flusso che rende l'espettorato suscettibile di sviluppare diagnostica ad alto rendimento della malattia polmonare.

Introduzione

I progressi tecnici nell'hardware e nel software dei citometri a flusso hanno permesso di identificare contemporaneamente molte popolazioni cellulari distinte1,2,3,4. L'utilizzo del citometro a flusso nella ricerca sulle cellule ematopoietiche, ad esempio, ha portato a una comprensione molto migliore del sistema ^immunitario2 e della gerarchia cellulare del sistema ematopoietico5, nonché alla distinzione diagnostica di una moltitudine di diversi tumori del ^sangue6,7,8

Protocollo

Tutte le fasi della lavorazione dell'espettorato vengono eseguite in un armadio di sicurezza biologica con adeguati dispositivi di protezione individuale.

1. Preparazione del reagente prima di iniziare la dissociazione dell'espettorato

1. Scongelare l'1% di paraformaldeide (PFA), 25 ml per campione su ghiaccio e mantenere freddo fino all'uso.
   ATTENZIONE: il PFA è tossico per inalazione e contatto con la pelle. Preparare il fissativo secondo le istruzioni del produttore e congelare a -20 °C in aliquote da 25 ml fino all'uso.
2. Approssimare il peso del campione e scongelare abbastanza 0,1% di ditiotreitolo (DTT) per il passa....

Risultati

Questo protocollo è stato sviluppato pensando a un ambiente di laboratorio clinico. Durante lo sviluppo del protocollo ci si è concentrati sulla semplicità, l'efficienza e la riproducibilità. Si è scoperto che la fase più dispendiosa in termini di tempo nell'elaborazione dell'espettorato era il conteggio delle cellule. Pertanto, il protocollo è impostato in modo tale che l'elaborazione dell'espettorato e l'etichettatura delle cellule possano essere eseguite indipendentemente dal conteggio delle cellule senza perdita di t.......

Discussione

Il contenuto cellulare dell'espettorato comprende una grande varietà di cellule ad ampio raggio, spesso accompagnate da molti ^detriti37. Inoltre, l'analisi dell'espettorato richiede un controllo di qualità che confermi che il campione viene raccolto dal polmone anziché dalla cavità ^orale38. Pertanto, non è così semplice analizzare l'espettorato mediante citometria a flusso come lo è per il sangue, ad esempio, che rilascia una sospensione cellulare molto più pulita e omogene.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1% Paraformaldeide Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µ Filtri cellulari in nylon M, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
Provetta conica di falco da 50 ml	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-umano CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-umano CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-citocheratina umana	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3 e CD19 Isotipo	BioLegend	400129
BV510 anti-umano CD45	BioLegend	304036
CD66b Isotipo FITC	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Perline di compensazione	BD Biosciences	560497
Corning Polistirene flacone sterile monouso 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polistirene flacone sterile monouso 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS& Perline a T	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-umano CD66b	GeneTex	GTX75907
Macchia di vitalità riparabile	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Perline, 05 μ M	Polysciences	64080
Perline NIST, 20 μ M	Polysciences	64160
Perline NIST, 30 μ M	Polysciences	64170
PE anti-umano CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-umano EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotipo	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-umano CD206	BD Biosciences	564063
Citrato di sodio diidrato	EMD	SX0445-1
Soluzione di blu di tripano, 0,4%	Fisher Scientific	15250061