Method Article

Microscopia a illuminazione strutturata a super-risoluzione e isolamento dei nuclei per l'esame delle alterazioni delle nucleoporine nella neurodegenerazione umana

DOI:

10.3791/62789

⸱

September 10th, 2021

 , 
1Brain Science Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro ottimizzato per l'isolamento dei nuclei e la microscopia ad illuminazione strutturata a super-risoluzione per valutare le singole nucleoporine all'interno del nucleoplasma e le NPC nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte e nei tessuti umani post mortem.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il complesso dei pori nucleari (NPC) è una struttura macromolecolare complessa composta da più copie di ~30 diverse proteine nucleoporine (Nups). Collettivamente, questi Nup funzionano per regolare l'organizzazione del genoma, l'espressione genica e il trasporto nucleocitoplasmatico (NCT). Recentemente, i difetti della NCT e le alterazioni di specifici Nup sono stati identificati come patologie precoci e prominenti in molteplici malattie neurodegenerative, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la malattia di Alzheimer (AD)/demenza frontotemporale (FTD) e la malattia di Huntington (HD). I progressi nella microscopia ottica ed elettronica consentono un esame approfondito delle strutture subcellulari, tra cui l'NPC e i suoi costituenti Nup, con maggiore precisione e risoluzione. Tra le tecniche comunemente utilizzate, la microscopia ad illuminazione strutturata (SIM) a super-risoluzione offre l'opportunità senza precedenti di studiare la localizzazione e l'espressione di singoli Nup utilizzando strategie di marcatura convenzionali basate su anticorpi. L'isolamento dei nuclei prima della SIM consente la visualizzazione delle singole proteine Nup all'interno dell'NPC e del nucleoplasma in uno spazio 3D completamente e accuratamente ricostruito. Questo protocollo descrive una procedura per l'isolamento dei nuclei e la SIM per valutare l'espressione e la distribuzione di Nup in cellule del SNC derivate da iPSC umane e tessuti post mortem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prevalenza delle malattie neurodegenerative legate all'età è in aumento con l'invecchiamento della popolazione1. Mentre le basi genetiche e le caratteristiche patologiche sono ben caratterizzate, gli eventi molecolari precisi che portano al danno neuronale rimangono poco compresi2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Recentemente, un G4C2 l'espansione delle ripetizioni esanucleotidiche nel primo introne del gene C9orf72 è stata identificata come la causa genetica più comune delle malattie neurodegenerative correlate: la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la demenza frontotemporale (FTD)13,14. Diversi studi ora supportano un ruolo centrale per le interruzioni nel meccanismo di trasporto nucleare, compresi i complessi di pori nucleari (NPC) e i recettori di trasporto nucleare (NTR, carioferine), come causali della SLA C9orf7215,16. Nelle cellule non in divisione all'interno del cervello di ratto, le nucleoporine dell'impalcatura (Nups) sono estremamente longeve. Di conseguenza, durante l'invecchiamento sono state riportate alterazioni di NPC e NCT17,18,19,20. Inoltre, alcune nucleoporine o trasporte, quando mutate, sono legate a specifiche malattie neurologiche21,22. Ad esempio, le mutazioni in Nup62 sono state collegate alla necrosi striatale bilaterale infantile (IBSN), una malattia neurologica che colpisce il nucleo caudato e il putamen23; mutazioni in Gle1 sono state implicate nella malattia del motoneurone fetale Sindrome da contrattura congenita letale-1 (LCCS1)24; e le mutazioni in Aladin sono causali della sindrome da tripla A25. Le alterazioni della NCT funzionale sono esacerbate nelle malattie neurodegenerative legate all'età come la SLA, la malattia di Huntington (HD) e il morbo di Alzheimer (AD)16,26,27,28,29,30,31. Inoltre, specifici Nup e NTR sono stati riportati come modificatori della tossicità mediata da C9orf72 nel Drosophila occhio28 o modificare biochimicamente lo stato di aggregazione di proteine legate alla malattia come FUS e tau27,32,33,34. Collettivamente, questi primi studi suggeriscono che l'alterazione dell'NCT può essere una caratteristica patologica primaria e precoce della SLA e della FTD. Gli studi sul sistema di modelli basati sulla sovraespressione hanno suggerito che l'errata localizzazione di specifici Nups e carioferine può avere un impatto sulla NCT16,35,36,37,38. Tuttavia, questi studi patologici non collegano effettivamente gli accumuli citoplasmatici di proteine NPC a difetti nella struttura o nella funzione dell'NPC. Ad esempio, questa patologia può semplicemente riflettere la disregolazione dei pool citoplasmatici delle proteine Nup con scarso impatto sulla composizione e sulla funzione delle NPC. Al contrario, un recente studio che impiega la microscopia ad illuminazione strutturata (SIM) a super risoluzione dimostra l'emergere di una lesione significativa alla NPC stessa, caratterizzata dalla riduzione dei livelli specifici di Nup all'interno del nucleoplasma e delle NPC dei neuroni umani C9orf72 ALS/FTD, che in ultima analisi porta a un'alterazione della funzione NPC come evento iniziale nelle cascate di malattie patogene15.

Il passaggio delle macromolecole tra il nucleo e il citoplasma è governato dal complesso dei pori nucleari (NPC). L'NPC è un grande complesso macromolecolare incorporato nell'involucro nucleare composto da copie multiple di 30 proteine nucleoporine (Nups)39,40,41. Sebbene la stechiometria Nup vari tra i tipi di cellule 42,43,44, il mantenimento della composizione complessiva dell'NPC è fondamentale per l'NCT, l'organizzazione del genoma e la vitalità cellulare complessiva 39,41,45,46. Di conseguenza, è probabile che l'alterazione della composizione delle NPC e i conseguenti difetti nel trasporto funzionale abbiano un impatto su una miriade di funzioni cellulari a valle. I costituenti Nup dell'NPC sono altamente organizzati in molteplici sottocomplessi, tra cui l'anello citoplasmatico e i filamenti, il canale centrale, l'anello esterno, l'anello interno, l'anello transmembrana e il cestello nucleare. Collettivamente, i Nup dell'anello interno, esterno e transmembrana ancorano le NPC all'interno dell'involucro nucleare e forniscono punti di ancoraggio per le Nup dell'anello citoplasmatico, del canale centrale e del cestello nucleare. Mentre piccole molecole (<40-60 kD) possono diffondere passivamente attraverso l'NPC, il trasporto attivo di carichi più grandi è facilitato dalle interazioni tra i recettori di trasporto nucleare (NTR, carioferine) e i Nup FG dei filamenti citoplasmatici, del canale centrale e del paniere nucleare 39,40,41,45. Inoltre, una manciata di Nup può anche funzionare al di fuori dell'NPC, all'interno del nucleoplasma, per regolare l'espressione genica46,47.

Dato che la dimensione laterale di una singola NPC umana è di circa 100-120 nm40, la microscopia standard a campo largo o confocale è insufficiente per risolvere le singole NPC48. Le tecniche di microscopia elettronica (EM) come TEM o SEM sono spesso utilizzate per valutare la struttura complessiva delle NPC39,40. Nonostante i vantaggi di queste tecniche per risolvere l'ultrastruttura delle NPC, sono meno comunemente utilizzate per valutare la presenza di singole proteine Nup all'interno delle NPC. I limiti tecnici della combinazione di marcatura basata su anticorpi o tag con queste tecnologie all'avanguardia, TEM e SEM, non sempre consentono una valutazione accurata e affidabile dei singoli Nup stessi all'interno delle NPC o del nucleoplasma. Inoltre, queste tecniche possono essere tecnicamente impegnative e non sono ancora ampiamente accessibili a tutti i ricercatori. Tuttavia, i recenti progressi nella microscopia a luce e a fluorescenza hanno aumentato l'accessibilità delle tecnologie di imaging a super-risoluzione. In particolare, la SIM offre l'opportunità senza precedenti di visualizzare singoli Nup con una risoluzione che si avvicina alle dimensioni laterali di un NPC umano 40,48,49,50,51. A differenza di altri approcci a super-risoluzione come la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM) e la deplezione di emissione stimolata (STED), la SIM è compatibile con l'immunocolorazione convenzionale basata su anticorpi49. Pertanto, la SIM consente un'analisi completa di tutti i Nup per i quali è disponibile un anticorpo Nup specifico. La capacità di campionare e visualizzare più Nup diversi nella stessa preparazione offre vantaggi significativi ad altri metodi di imaging durante l'indagine delle numerose proteine che compongono l'NPC. La seguente procedura descrive in dettaglio un protocollo ottimizzato per la valutazione dei singoli componenti Nup dell'NPC utilizzando nuclei isolati da neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e tessuti del sistema nervoso centrale umano (SNC) post mortem.

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Protocol

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Tutti i campioni di sangue per la generazione di iPSC e le raccolte di tessuti autopsici sono approvati dalla Johns Hopkins IRB con la supervisione etica della Johns Hopkins. Tutte le informazioni per i pazienti sono conformi all'HIPPA. Il seguente protocollo aderisce a tutte le procedure di biosicurezza della Johns Hopkins.

1. Preparazione di vetrini per immunocolorazione e imaging

  1. Posizionare un vetrino da microscopio caricato positivamente in un citoimbuto vuoto e disegnare un cerchio con una penna barriera idrofobica per delineare un'area in cui depositare i nuclei.
  2. Aggiungere 50 μL di soluzione di collagene da 1 mg/mL (diluita in 1x PBS) al centro del cerchio disegnato al punto 1.1 e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
  3. Aspirare la soluzione di collagene e lasciare asciugare i vetrini all'aria a temperatura ambiente per circa 1 ora.

2. Preparazione del tampone di lisi e dei gradienti di saccarosio

  1. Preparare il tampone di lisi e le soluzioni a gradiente di saccarosio secondo il protocollo del kit di isolamento dei nuclei.
    1. Per ogni campione, preparare una provetta conica da 50 mL di tampone di lisi combinando 11 mL del tampone di lisi fornito, 110 μL della soluzione Triton X-100 al 10% fornita e 11 μL di DTT 1 M (Ditiotreitolo) appena preparato o scongelato.
    2. Per ogni campione, utilizzare una provetta conica da 50 ml per preparare una soluzione a cuscino di saccarosio 1,85 M combinando 27,75 ml della soluzione a cuscino di saccarosio 2 M in dotazione, 2,25 in ml del tampone a cuscino in saccarosio in dotazione e 30 μl di DTT 1 M appena preparato o scongelato.
      NOTA: Una soluzione a cuscino di saccarosio da 1,85 M è ottimale per iPSN e tessuti del SNC umano post mortem, ma regolarla per altri tipi di cellule o campioni di tessuto. Ulteriori dettagli sulle cellule HEK293, sugli astrociti derivati da iPSC e sull'arricchimento di nuclei di oligodendrociti da tessuti post mortem del SNC sono stati recentemente pubblicati15.
  2. Mescolare delicatamente il tampone di lisi e le soluzioni a cuscino di saccarosio capovolgendo i tubi conici e conservarli in ghiaccio.

3. Lisi delle iPSNs e del tessuto nervoso centrale umano post mortem

  1. Prima di procedere con la lisi, posizionare il rotore dell'ultracentrifuga (senza portacampioni) nell'ultracentrifuga e lasciarlo preraffreddare a 4 °C.
  2. Lisi degli iPSNs.
    NOTA: I protocolli di lisi differiscono per le iPSN e per il tessuto umano del SNC post mortem. Seguire il protocollo per il tipo di campione specificato di seguito (passaggio 3.2: iPSN, passaggio 3.3: tessuto umano del SNC post mortem).
    1. Rimuovere gli iPSN dall'incubatrice e aspirare il fluido. Sciacquare brevemente con 1x PBS e aggiungere il tampone di lisi direttamente nel pozzetto o nella piastra.
      NOTA: Fare attenzione a sciacquare adeguatamente gli iPSN con una quantità sufficiente di 1x PBS per rimuovere detriti e cellule morte. Il volume del tampone di lisi da aggiungere alle piastre iPSN varia. Fare riferimento alla Tabella 1. Assicurati che il materiale di partenza sia >2,5 milioni di iPSN.
    2. Raschiare le iPSN con un raschietto cellulare e trasferirle nel tampone di lisi rimanente nella provetta conica da 50 mL.
    3. Tappare ogni provetta conica e agitare i campioni per 20 s per facilitare la lisi dell'iPSN.
    4. Lasciare riposare i campioni sul ghiaccio per 1-2 minuti prima di procedere.
  3. Lisi di tessuti umani del SNC post mortem.
    1. Pesare ~ 100 mg di tessuto nervoso centrale umano congelato post-mortem tagliandolo con una lama di rasoio in una capsula di Petri posta su un letto di ghiaccio secco. Assicurati di lavorare su una superficie circondata da tamponi monouso per evitare la contaminazione locale dei tessuti. Prestare attenzione alle dissezioni specifiche della materia grigia rispetto alla sostanza bianca (ad esempio, mensola corticale rispetto alla sostanza bianca sottostante) visibili al momento della dissezione dei tessuti.
      NOTA: Indossare i DPI appropriati, compresi gli indumenti protettivi per gli occhi e i guanti quando si maneggiano campioni di tessuto umano congelati post mortem. Questo passaggio può anche essere completato in anticipo e le aliquote tissutali possono essere conservate a -80 °C. 50 mg è una quantità sufficiente per l'isolamento dei nuclei. Tuttavia, più di 100 mg di tessuto spesso producono un isolamento incompleto dei nuclei, come evidenziato dalla presenza di citoplasma intatto che circonda alcuni nuclei.
    2. Preparare l'omogeneizzatore Dounce pulendo e risciacquando accuratamente con acqua distillata. Raffreddare l'omogeneizzatore mettendolo sul ghiaccio.
    3. Aggiungere 100 mg di fazzoletto all'omogeneizzatore Dounce appena pulito, risciacquato e raffreddato (con ghiaccio) contenente 2 ml del tampone di lisi preparato.
    4. Omogeneizzare nell'omogeneizzatore Dounce utilizzando la procedura standard sul ghiaccio.
      NOTA: In genere, 10-20 colpi per pestello sono sufficienti per muoversi attraverso il campione senza resistenza.
    5. Trasferire 2 mL di omogeneizzato di cervello umano post-mortem ai restanti 9 mL di tampone di lisi in provette coniche.
    6. Agitare energicamente per 30 s e lasciare riposare sul ghiaccio per 5 min per facilitare la lisi.

4. Isolamento di nuclei da iPSN e tessuto del SNC umano post mortem

  1. Stendere 10 mL di soluzione cushion di saccarosio 1,85 M (prodotta al punto 2.1.2) sul fondo di una provetta per ultracentrifuga e aggiungere 18 mL di soluzione cushion di saccarosio 1,85 M a ciascun lisato.
  2. Miscelare delicatamente la soluzione di cuscino lisato/saccarosio (combinata al punto 4.1) capovolgendo la provetta conica da 50 mL.
  3. Aggiungere lentamente 28 mL di soluzione cushion di lisato/saccarosio alla sommità dei 10 mL di soluzione cushion di saccarosio 1,85 M nella provetta per ultracentrifuga (dal passaggio 4.1).
    NOTA: Nella provetta conica da 50 mL è presente una miscela totale di 29 mL di soluzione a cuscino di lisato/saccarosio (passaggi 4.1-4.2). Lasciare 1 mL di questa miscela di soluzione a cuscino lisato/saccarosio nella provetta conica da 50 mL. Ciò garantisce un pipettaggio accurato e uniforme tra tutti i campioni grazie alla viscosità della soluzione a cuscino di saccarosio.
  4. Posizionare le provette per ultracentrifuga nei supporti e aggiungere un'ulteriore soluzione di cuscino di saccarosio 1,85 M (prodotta al punto 2.1.2) secondo necessità per bilanciare i campioni.
  5. Posizionare i portacampioni nel rotore dell'ultracentrifuga refrigerata e centrifugare a 30.000 x g, 4 °C per 45 minuti.
  6. Rimuovere le provette per ultracentrifuga dai portacampioni ed eliminare i surnatanti. I nuclei saranno visibili sotto forma di pellet sui lati inferiori della provetta dell'ultracentrifuga.
  7. Risospendere i pellet di nuclei in 1 mL del tampone di conservazione dei nuclei fornito mediante vortex e trasferirli in una provetta da microcentrifuga.
  8. Centrifugare le provette per microcentrifuga a 2.500 x g, 4 °C per 5 minuti.
  9. Rimuovere il surnatante e risospendere i nuclei facendo vorticare in 1 mL fresco del tampone di conservazione dei nuclei fornito.
  10. Procedere con l'immunocolorazione o conservare i nuclei a -80 °C.
    NOTA: I nuclei possono essere conservati a -80 °C per un massimo di 6 mesi ed essere sottoposti a due cicli di congelamento/disgelo prima che l'integrità strutturale sia compromessa.

5. Immunocolorazione dei nuclei isolati

  1. Prelevare un'aliquota di 10 μl della sospensione di nuclei e contare utilizzando un ematocitometro o un contatore automatico di cellule.
  2. Assemblare i vetrini preparati (dal passaggio 1.3) nei citoimbuti.
  3. A ciascun citoimbuto, sovrapporre 200 μL di tampone di conservazione dei nuclei freschi e ~100.000 nuclei.
  4. Far girare delicatamente i nuclei sui vetrini posizionando i citoimbuti in un citospin e centrifugando per 3 minuti a 100 x g.
  5. Sganciare i citocanali e aggiungere immediatamente ~100 μL di PFA al 4% (paraformaldeide) ai vetrini e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: I nuclei possono anche essere fissati con metanolo. Utilizzare un metodo di fissazione appropriato per ciascun anticorpo. Se si utilizza metanolo, saltare la fase di permeabilizzazione (5.7). I citoimbuti sono monouso; Scartali a questo punto.
  6. Lavare i nuclei 3 volte per 5 minuti con 1 PBS.
  7. Permeabilizzare i nuclei con Triton X-100 allo 0,1% in 1x PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
  8. Bloccare i nuclei in una soluzione a blocchi (10% di siero di capra o d'asino in 1x PBS) per 30 minuti a temperatura ambiente.
  9. Incubare i nuclei con anticorpi primari diluiti in soluzione a blocchi per una notte a 4 °C.
  10. Lavare i nuclei 3 volte per 5 minuti con 1 PBS.
  11. Incubare i nuclei con anticorpi secondari diluiti in soluzione a blocchi per 1 ora a temperatura ambiente.
    NOTA: Gli anticorpi secondari Alexa Fluor 488, 568 e 647 sono preferiti.
  12. Lavare i nuclei 3 volte per 5 minuti con 1 PBS.
  13. FACOLTATIVO: Incubare i nuclei per 5 minuti con DAPI o Hoechst seguiti da altri due lavaggi di 5 minuti con 1x PBS.
  14. Tenere un panno privo di lanugine sul bordo del cerchio contenente i nuclei per rimuovere completamente l'ultimo lavaggio PBS.
  15. Aggiungere 1 goccia (~10 μL) di un supporto di montaggio antisbiadimento a montaggio rigido (senza DAPI) su ciascun vetrino e posizionare delicatamente i vetrini coprioggetti quadrati ad alta tolleranza da 18 mm x 18 mm su ciascun vetrino.
    NOTA: Quando si utilizza un supporto rigido, la sigillatura dei vetrini non è necessaria se le diapositive vengono riprodotte entro un intervallo di tempo appropriato. L'immunoreattività Nup è rimasta tipicamente stabile su vetrini non sigillati conservati a 4 °C per ~6 mesi. Tuttavia, i bordi del vetrino coprioggetti possono essere sigillati con un sottile strato di smalto per unghie se si utilizza un supporto a umido o per una conservazione prolungata.
  16. Tenere i vetrini al riparo dalla luce e lasciarli indurire per una notte a temperatura ambiente.
  17. L'immagine dei nuclei può essere effettuata mediante microscopia a illuminazione strutturata (SIM) a super-risoluzione.
    NOTA: Zeiss, Nikon e GE Healthcare producono tutti microscopi SIM. Seguire i protocolli specifici del sistema per l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini. Utilizzare i parametri di imaging (potenza del laser, set di filtri, tempo di esposizione) appropriati per ogni Nup e fluoroforo. Durante l'imaging, evitare i bordi del cerchio (dal passaggio 1.1) poiché questi nuclei sono tipicamente appiattiti e distribuiti a seguito della fase di centrifugazione (5.4). Le immagini completamente deconvolute ed elaborate possono essere sottoposte a una serie di analisi, tra cui il rilevamento di punti e le misurazioni del volume utilizzando moduli di analisi 3D standard nel software di analisi delle immagini FIJI o Imaris. Ulteriori dettagli sui metodi di analisi sono stati recentemente pubblicati15.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per esaminare la NPC e la distribuzione nucleoplasmatica e l'espressione di POM121 nei nuclei neuronali umani, le iPSN di controllo e C9orf72 sono state differenziate come precedentemente descritto15. La corteccia motoria umana post-mortem e gli iPSN del giorno 32 sono stati lisati e sottoposti a isolamento dei nuclei e immunocolorazione come descritto sopra. I nuclei isolati positivi per NeuN sono stati ripresi mediante microscopia a illuminazione strutturata (SIM) a super-risoluzione utilizzando...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Data la recente identificazione dei deficit di NCT come fenomeno precoce e prominente in molteplici malattie neurodegenerative 16,27,28,30,31, esiste una necessità critica di esaminare a fondo il meccanismo attraverso il quale si verifica questa patologia. Poiché l'NPC e le sue singole proteine Nup controllano in modo critico ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I tessuti umani post-mortem del SNC sono stati forniti dalla Johns Hopkins ALS Autopsy Bank e dal Target ALS Postmortem Tissue Core. Questo lavoro è stato supportato dall'ALSA Milton Safenowitz Postdoctoral Fellowship (ANC), nonché dai finanziamenti di NIH-NINDS, Dipartimento della Difesa, ALS Association, Muscular Dystrophy Association, F Prime, The Robert Packard Center for ALS Research Answer ALS Program e Chan Zuckerberg Initiative.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provette coniche da 50 mLFisher Scientific14-959-49A
Beckman UltracentrifugaBeckman Coulter
Raschietti cellulariSarstedt83.183
CollageneAdvanced Biomatrix5005
Vetrini coprioggettiMatTekPCS-170-1818
CytofunnelThermo Fisher Scientific
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003
Omogeneizzatori Dounce DWKLife Sciences357542
DTTSigma AldrichD0632
Eppendorf tubiFisher Scientific05-408-129
Capra Anti-Pollo Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
Capra Anti-Topo Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
Capra Anti-Topo Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
Capra Anti-Topo Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
Capra Anti-Coniglio Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Capra Anti-Coniglio Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
Capra Anti-Coniglio Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
Capra Anti-Ratto Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
Capra Anti-Ratto Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
Capra Anti-Ratto Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
EmatocitometroFisher Scientific267110
Vetrini per microscopioFisher Scientific12-550-15
Siero di capra normaleVector LabsS-1000
Nuclei PURE Prep Kit di isolamento dei nucleiSigma AldrichNUC201Contiene tampone di lisi, Triton X-100 al 10%, gradiente di saccarosio 2 m, soluzione di cuscino di saccarosio e tampone di conservazione dei nuclei; Indicato nel protocollo come "kit di isolamento dei nuclei"
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold AntifadeInvitrogenP36930Indicato nel protocollo come "supporto di montaggio antifading a montaggio rigido"
SW 32 Ti Ultracentrifuge RotorBeckman Coulter369694Indicato nel protocollo come "rotore per ultracentrifuga"
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Trypan BlueThermo Fisher Scientific15-250-061
Provette per ultracentrifugaBeckman Coulter344058
Anticorpi primarinucleoporiniciGli anticorpi primari adatti per la rilevazione immunofluorescente di nucleoporine individuali sono disponibili presso diverse aziende.
A78710020

References

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