Domini replicativi di imaging in cromatina conservata ultrastrutturalmente mediante tomografia elettronica

Sophie Sosnovskaya; Amir N. Zakirov; Ekaterina D. Ryumina; Ekaterina Kharybina; Sergei A. Golyshev; Olga S. Strelkova; Oxana A. Zhironkina; Andrei Moiseenko; Anton Orekhov; Igor I. Kireev

doi:10.3791/62803

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Articolo metodologico

Domini replicativi di imaging in cromatina conservata ultrastrutturalmente mediante tomografia elettronica

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DOI:

10.3791/62803

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20 maggio 2022

Sophie Sosnovskaya^*¹^,² , Amir N. Zakirov^*¹^,² , Ekaterina D. Ryumina^*¹^,³ , Ekaterina Kharybina¹^,² , Sergei A. Golyshev¹ , Olga S. Strelkova¹ , Oxana A. Zhironkina¹ , Andrei Moiseenko² , Anton Orekhov⁴ , Igor I. Kireev¹^,²^,⁵

¹Belozersky Institute of Physico-chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, ²Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, ³Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, ⁴National Research Center, Kurchatov Institute, ⁵V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology, and Perinatology

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta una tecnica per la mappatura ad alta risoluzione dei siti di replicazione in cromatina strutturalmente conservata in situ che impiega una combinazione di marcatura EdU-streptavidin-Nanogold pre-incorporante e ChromEMT.

Abstract

I principi del ripiegamento del DNA nel nucleo cellulare e le sue trasformazioni dinamiche che avvengono durante l'adempimento delle funzioni genetiche di base (trascrizione, replicazione, segregazione, ecc.) rimangono poco compresi, in parte a causa della mancanza di approcci sperimentali alla visualizzazione ad alta risoluzione di specifici loci di cromatina in nuclei strutturalmente conservati. Qui presentiamo un protocollo per la visualizzazione di domini replicativi in colture cellulari monostrato in situ, combinando l'etichettatura EdU del DNA appena sintetizzato con la successiva rilevazione dell'etichetta con Ag-amplificazione delle particelle Nanogold e colorazione ChromEM della cromatina. Questo protocollo consente l'etichettatura pre-incorporamento ad alto contrasto e ad alta efficienza, compatibile con la tradizionale fissazione della glutaraldeide che fornisce la migliore conservazione strutturale della cromatina per l'elaborazione dei campioni a temperatura ambiente. Un altro vantaggio dell'etichettatura pre-incorporante è la possibilità di preselezionare le celle di interesse per il sezionamento. Ciò è particolarmente importante per l'analisi di popolazioni cellulari eterogenee, nonché per la compatibilità con gli approcci di tomografia elettronica all'analisi 3D ad alta risoluzione dell'organizzazione della cromatina nei siti di replicazione e all'analisi del riarrangiamento della cromatina post-replicativa e della segregazione cromatidica sorella nell'interfase.

Introduzione

La replicazione del DNA è un processo biologico di base necessario per la copia fedele e la trasmissione delle informazioni genetiche durante la divisione cellulare. Negli eucarioti superiori, la replicazione del DNA è soggetta a una stretta regolazione spazio-temporale, che si manifesta nell'attivazione sequenziale delle origini di replicazione¹. Le origini di replica vicine che sparano in modo sincrono formano cluster di replicons². A livello di microscopia ottica, i siti di replicazione del DNA in corso vengono rilevati come focolai di replicazione di vari numeri e dimensioni. I focolai di replicazione mostrano modell....