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Articolo metodologico

Dolore indotto da ustioni e comportamento simile alla depressione nei topi

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DOI:

10.3791/62817

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29 settembre 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Medical Science, College of Medicine and Brain Research Institute, Chungnam National University, 2Department of Pharmacology, Catholic Kwandong University College of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Una lesione transitoria da scottatura (65 °C ± 0,5 °C, 3 s) di una zampa posteriore riduce la soglia (g) alla stimolazione del filamento di von Frey del lato ipsilaterale e altera il modello dell'andatura. Inoltre, la lesione da ustione induce un comportamento simile alla depressione nel test di nuoto forzato.

Abstract

L'acqua scottante è la causa più comune di ustioni sia nelle popolazioni anziane che in quelle giovani. È una delle principali sfide cliniche a causa dell'alta mortalità e delle sequele nei paesi a basso e medio reddito. Le ustioni spesso inducono intenso dolore spontaneo e allodinia persistente, nonché problemi potenzialmente letali. Ancora più importante, il dolore eccessivo è spesso accompagnato da depressione, che può ridurre significativamente la qualità della vita. Questo articolo mostra come sviluppare un modello animale per lo studio del dolore indotto da ustioni e del comportamento simile alla depressione. Dopo l'anestesia, la lesione da ustione è stata indotta immergendo una zampa posteriore del topo in acqua calda (65 ° C ± 0,5 ° C) per 3 s. Il test di von Frey e l'analisi automatizzata dell'andatura sono stati eseguiti ogni 2 giorni dopo la lesione da ustione. Inoltre, il comportamento simile alla depressione è stato esaminato utilizzando il test di nuoto forzato e il test a rotazione è stato eseguito per differenziare la funzione motoria anormale dopo la lesione da ustione. Lo scopo principale di questo studio è descrivere lo sviluppo di un modello animale per lo studio del dolore indotto da ustioni e del comportamento simile alla depressione nei topi.

Introduzione

Il danno tissutale, come ustioni e traumi, è generalmente associato alla co-occorrenza di dolore acuto. Le ustioni e i sintomi legati al trauma sono stimati in 1.80.000 morti ogni anno causati da ustioni: la stragrande maggioranza si verifica nei paesi a basso e medio reddito da diversi tipi di ustioni1. Secondo un rapporto mondiale, le ustioni sono comuni nei bambini e rappresentano circa il 40% -60% dei pazienti ospedalizzati 2,3. Queste lesioni specifiche sono ancora più gravi in quanto possono verificarsi nella vita di tutti i giorni, come l'ebollizione o l'acqua di balneazione 4,5. Sebbene il dolore acuto possa essere risolto spontaneamente dopo il recupero dal danno tissutale nella maggior parte dei casi, può essere possibile diventare cronico a causa di cambiamenti anormali nel sistema nervoso 6,7.

Recentemente, è stato suggerito che il dolore acuto può indurre uno stato d'animo depresso e il dolore cronico può causare ansia e depressione 8,9,10,11. La coesistenza di dolore e depressione rende più difficile trattare il paziente. La depressione tende anche ad aumentare la sensibilità al dolore, che è probabile che induca depressione e dolore più intensi12. Le complicanze del dolore e della depressione sono mostrate in modelli animali di infiammazione periferica 13,14,15,16. I meccanismi dettagliati alla base della depressione indotta dal dolore non sono ben noti fino ad ora17. Pertanto, è necessario sviluppare trattamenti più efficaci per le ustioni per alleviare gli effetti collaterali e i sintomi.

Pertanto, il presente studio è stato progettato per sviluppare un modello animale per studiare il dolore acuto indotto da ustioni e il comportamento simile alla depressione nei topi. Per questo, sono stati misurati la sensibilità tattile anormale correlata alle ustioni, il modello di andatura alterato e il comportamento simile alla depressione. Inoltre, questo studio tenta di convalidare il modello utilizzando i FANS.

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Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso la Chungnam National University in Corea del Sud, e quindi condotti sulla base delle linee guida etiche dell'Associazione internazionale per lo studio del dolore18.

1. Induzione di lesioni da ustione scottante sulla zampa posteriore

  1. Ospitare i topi ICR maschi del peso di 20-25 g in una stanza luminosa e a temperatura controllata (ciclo luce-buio 12/12 h, 22,5 °C ± 2,5 °C) con un'umidità del 40%-60%.
    NOTA: sia i topi maschi che quelli femmine possono essere utilizzati per questo protocollo.
  2. Consentire all'animale il libero accesso al cibo e all'acqua e acclimatarsi per almeno 1 settimana prima di iniziare l'esperimento.
    NOTA: Tutti gli animali sono stati alloggiati in gruppo per escludere variabili come lo stress da isolamento.
  3. Assegna i topi in modo casuale al gruppo sperimentale o di controllo e conduci esperimenti ciechi usando numeri di animali come codici.
  4. Il giorno dell'induzione dell'ustione, anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di 300 μL di alfaxalone alla dose di 100 mg/kg. Indossare un camice chirurgico, guanti e maschera durante l'esecuzione dell'induzione dell'ustione.
  5. Dopo aver anestetizzato profondamente il mouse, disinfettare intorno alla zampa posteriore destra con il 70% di etanolo.
    NOTA: Controllare la mancanza di risposta alla stimolazione del pizzico applicata alle dita posteriori o alla coda per confermare lo stato di anestesia profonda.
  6. Applicare un unguento oftalmico agli occhi per prevenire l'essiccazione corneale dopo l'induzione dell'anestesia.
  7. Immergere la zampa posteriore destra del topo profondamente anestetizzato in acqua calda a 65 °C ± 0,5 °C per 3 s. Fai un segno sulla caviglia di ogni topo prima di immergere la zampa posteriore in acqua calda per mantenere la consistenza nella zona bruciata.
  8. Dopo l'induzione delle ustioni, portare i topi in una gabbia domestica pulita e metterli su una piastra riscaldante fino a quando gli animali non si riprendono dall'anestesia.
    NOTA: L'agente analgesico, paracetamolo (200 mg/kg), è stato somministrato per via intraperitoneale una volta al giorno per 7 giorni a partire dal giorno della ustione (solo burn + gruppo paracetamolo). Il gruppo Burn è stato trattato con soluzione salina come controllo del veicolo. L'esperimento è stato eseguito secondo il metodo descritto in uno studio precedente4.

2. Misurazione dell'allodinia meccanica

  1. Porta i topi nella sala di test comportamentali e lasciali acclimatare almeno per 30 minuti prima del test. Indossare un camice chirurgico, guanti e maschera durante l'esecuzione del test.
  2. Posizionare i topi in una scatola quadrata (diametro: 13 cm, altezza: 12 cm) su un pavimento in rete metallica (dimensioni della maglia: 0,7 cm x 0,7 cm) e lasciarli acclimatare per almeno 30 minuti.
  3. Valutare la soglia meccanica della zampa posteriore utilizzando il metodo dello stimolo ascendente19,20.
  4. Colpire delicatamente una serie di filamenti di von Frey con intervalli di 5-8 s per stimolare il plantare posteriore. Ottenere i valori basali il giorno prima dell'induzione della bruciatura.
    NOTA: I filamenti di von Frey da 0,16-1,2 g sono stati utilizzati nel test per misurare la soglia di prelievo della zampa in tutti gli animali, rispettivamente. Il test di risposta al ritiro della zampa è stato avviato con la più bassa forza di flessione del filamento di von Frey (0,16 g in questo protocollo). Se non c'era risposta, veniva applicato un filamento con la forza di flessione successiva.
  5. Eseguire cinque prove per valutare le soglie meccaniche per ogni zampa posteriore ipsilaterale (ferita).
    NOTA: La forza di flessione del filamento di von Frey che produce risposta più di tre volte delle cinque prove in ciascun animale è stata espressa come soglia di prelievo della zampa (PWT, g). Le soglie meccaniche sono state misurate un giorno prima e a 1, 3, 5 e 7 giorni dopo la lesione da ustione. L'effetto analgesico è stato valutato 1 ora dopo la somministrazione del paracetamolo nell'animale.

3. Analisi automatizzata dell'andatura

  1. Acclimatare i topi nel sistema di analisi dell'andatura una volta al giorno per 10-15 minuti da 5 giorni prima della lesione da ustione. Indossare un camice chirurgico, guanti e maschera durante l'esecuzione dell'analisi dell'andatura.
  2. Il giorno del test, portare i topi nella sala test comportamentale e acclimatarli per almeno 30 minuti prima del test.
    NOTA: eseguire test di acclimatazione e analisi dell'andatura in un ambiente buio. Impostare le condizioni del menu del programma come segue.
    1. Dopo aver eseguito il programma, fare clic sul menu Crea nuovo esperimento per designare la cartella in cui salvare i dati.
    2. Dopo la designazione, impostare il tempo di funzionamento massimo su 5 s e le variazioni di velocità massime consentite al 50%.
    3. Selezionare una telecamera registrata e impostare la lunghezza della passerella su 30 cm nella scheda Configurazione del programma.
    4. Nella scheda Acquisisci del menu del programma, selezionare Apri acquisizione.
    5. In base ai messaggi di stato, fare clic sul pulsante Snap Background per acquisire un'immagine di sfondo di una passerella vuota.
  3. Fare clic sul pulsante Avvia acquisizione , quindi posizionare il mouse all'ingresso della passerella attraversabile sinistra-destra. La registrazione inizierà automaticamente seguendo il libero movimento del mouse.
    NOTA: se l'andatura dell'animale è stata registrata con successo e tutti i passi sono stati rilevati, verrà contrassegnato come Esecuzione conforme con un'icona verde. Se il software non rileva alcun passo, viene visualizzata un'icona rossa, nel qual caso si consiglia di eseguire nuovamente la registrazione. Gli autori raccomandano di raccogliere e analizzare almeno cinque esecuzioni conformi di successo eseguite con velocità di esecuzione simili.
  4. Nella scheda Acquisisci del menu del programma selezionare Classifica esecuzioni.
    NOTA: dopo aver selezionato i dati ottenuti dall'esecuzione di conformità riuscita sopra, passare alla schermata di analisi video in cui sono stati registrati i modelli di andatura dei topi.
  5. Selezionare la corsa da analizzare e fare clic sul pulsante Auto Classify .
  6. Dopo aver eseguito la classificazione automatica, rimuovere il naso, il riconoscimento genitale e il riconoscimento errato delle zampe per i dati spazzatura in ogni corsa, quindi analizzare i dati.
    NOTA: tutti i parametri statistici vengono automaticamente analizzati e salvati nel programma e i valori dei dati grezzi possono essere trovati nel menu di analisi dello sperimentatore. L'analisi automatica dell'andatura è stata eseguita prima e a 1, 3, 5 e 7 giorni dopo la lesione da ustione. La valutazione è stata eseguita 30 minuti dopo la somministrazione di paracetamolo nel gruppo Burn + Paracetamolo e 30 minuti dopo il trattamento salino nel gruppo Burn. Questo esperimento è stato eseguito secondo il metodo descritto negli studi precedenti 4,21,22.

4. Misurazione del comportamento simile alla depressione

NOTA: Comportamento basato sulla disperazione, il tempo di immobilità in acqua è stato misurato dal test di nuoto forzato.

  1. Porta i topi nella sala di test comportamentale e acclimatali per almeno 30 minuti prima del test. Indossare un camice chirurgico, guanti e maschera durante l'esecuzione del test di nuoto forzato.
  2. Mettere il mouse in un cilindro di plexiglass trasparente (10 cm x 25 cm) contenente 15 cm di acqua (25 °C ± 0,5 °C) per 15 min.
  3. Dopo 24 ore, mettere il mouse nel cilindro delle stesse condizioni e misurare il tempo di immobilità.
    NOTA: Il tempo di immobilità è stato misurato per 5 minuti di tempo di prova e il tempo in cui i topi hanno smesso di arrampicarsi o nuotare e galleggiavano per mantenere la testa sopra la superficie dell'acqua è stato registrato. Il test di nuoto forzato è stato eseguito il giorno 7 dopo l'ustione. La valutazione è stata eseguita 1 ora dopo la somministrazione di paracetamolo nel gruppo Burn + Paracetamolo e 1 ora dopo il trattamento salino nel gruppo Burn. L'esperimento è stato eseguito secondo il metodo descritto in precedenti studi23,24.

5. Misurazione della normale funzione del motore

NOTA: Il test rota-rod è stato eseguito per differenziare la funzione motoria anormale dopo la lesione da ustione.

  1. Porta i topi nella sala di test comportamentale e acclimatali per almeno 30 minuti prima del test. Indossare un camice chirurgico, guanti e maschera durante l'esecuzione del test di nuoto forzato.
  2. Posizionare gli animali su una piattaforma cilindrica rotante (5,7 cm di larghezza; 3 cm di diametro) sospesa a 16 cm sopra il fondo dell'apparecchio.
  3. Lasciare che ogni animale si alleni una volta al giorno su un'asta rotante per almeno 5 giorni prima dell'induzione di ustioni.
  4. Eseguire il test rota-rod ogni 20 minuti per 2 ore dopo la somministrazione del farmaco. Impostare il tempo limite su 2 min.
  5. Misurare la durata del tempo in cui il mouse scorre su un'asta rotante alla velocità costante di 15 giri al minuto senza cadere.
    NOTA: Il test rota-rod è stato eseguito 7 giorni dopo l'induzione della lesione da ustione. La valutazione è stata eseguita immediatamente dopo la somministrazione di paracetamolo nel gruppo Burn + Paracetamolo e dopo il trattamento salino nel gruppo Burn. Alfaxalone è stato utilizzato come controllo positivo per i farmaci trattati sperimentalmente in questo test. Durante il test rotarod, viene misurata la durata del tempo in cui il mouse scorre sull'asta rotante senza cadere. L'esperimento è stato eseguito secondo il metodo descritto in precedenti studi22,25.

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Risultati

Al fine di ridurre al minimo la sofferenza animale e ridurre il numero di animali utilizzati secondo le linee guida Three R (Replacement, Reduction, and Refinement), questo studio è stato progettato con il numero minimo di animali per la raccolta di dati significativi stabiliti attraverso esperimenti preliminari. In questo studio, gli esperimenti comportamentali sono stati condotti in modo indipendente due volte come segue. L'analisi dell'andatura, l'allodinia meccanica e i test di comportamento simile alla depressione s...

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Discussione

La scottatura è una sorta di bruciatura termica causata da liquidi riscaldati. È stato suggerito che le ustioni di primo o secondo grado si verificano nella maggior parte dei casi, ma il contatto a lungo termine con fonti di calore può causare ustioni di terzo grado26. Nel presente studio, la lesione da ustione è stata indotta esponendo la zampa posteriore destra dei topi in acqua calda a 65 ° C per 3 s 4,26. Il danno tissutale è stato ril...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta dalla Chungnam National University e dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo della Corea (NRF-2019R1A6A3A01093963 e NRF-2021R1F1A1062509).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 1 mLBD307809
provetta da 1,5 mLAxygenMCT-150-C
provetta da 50 mLSPL50050
Acetaminofene BioXtra, ≥ 99,0%Sigma-AldrichA7085-100GQuesto agente analgesico viene utilizzato come controllo positivo.
Inquesto esperimento, questo materiale è stato utilizzato per l'anestesia animale ed è stato utilizzato come controllo positivo per i farmaci trattati sperimentalmente nel test rota-rod.
L'analisi dell'andatura in roditori che camminano liberamente viene utilizzata per studiare i cambiamenti nel movimento e nel posizionamento degli arti in modelli con disfunzione senso-motoria
OPTISHIELD (unguento oftalmico Cyclosporin)Ashish Life ScienceQuesto materiale è stato utilizzato per un unguento per prevenire l'essiccazione corneale dopo l'induzione dell'anestesia.
Cilindro in plexiglassSCITECH KOREAprodotti su misuraUtilizzato nel test di nuoto forzato
Sistema rota-rodSCITECH KOREAAsta di rotazione acceleranteUtilizzato nella misurazione della normale funzione motoria
dei filamenti von FreyCoast MedicalNC12775Utilizzato nella misurazione dell'allodinia meccanica
Bagno d'acquaCHANGSHIN SCIENCEC-WBEUtilizzato nell'induzione di lesioni da ustione
North

Riferimenti

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