Le vescicole extracellulari (EV) contribuiscono alla biologia cellulare e alle comunicazioni intercellulari. C'è bisogno di saggi pratici per visualizzare e quantificare l'assorbimento dei veicoli elettrici da parte delle cellule. L'attuale protocollo propone il test di assorbimento EV utilizzando l'imaging tridimensionale a fluorescenza tramite microscopia confocale, dopo l'isolamento EV da un dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione.
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Articolo metodologico
Test di assorbimento delle vescicole extracellulari tramite analisi di imaging al microscopio confocale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
C'è bisogno di saggi pratici per visualizzare e quantificare l'assorbimento delle vescicole extracellulari (EV) delle cellule. L'assorbimento di veicoli elettrici svolge un ruolo nella comunicazione intercellulare in vari campi di ricerca; biologia del cancro, neuroscienze e somministrazione di farmaci. Molti saggi di assorbimento dei veicoli elettrici sono stati riportati in letteratura; tuttavia, vi è una mancanza di metodologia sperimentale pratica e dettagliata. L'assorbimento dei veicoli elettrici può essere valutato etichettando in modo fluorescente i veicoli elettrici per rilevare la loro posizione all'interno delle cellule. Distinguere tra EV internalizzati nelle celle e EV superficiali sulle cellule è difficile, ma fondamentale, per determinare con precisione l'assorbimento ev. Pertanto, in questo lavoro viene proposto un test che quantifica in modo efficiente l'assorbimento di EV attraverso la microscopia confocale a fluorescenza tridimensionale (3D). I veicoli elettrici con etichetta fluorescente sono stati preparati utilizzando un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione, visualizzato mediante microscopia confocale 3D e quindi analizzato attraverso un software avanzato di elaborazione delle immagini. Il protocollo fornisce una solida metodologia per l'analisi dei veicoli elettrici a livello cellulare e un approccio pratico per un'analisi efficiente.
Introduzione
Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle legate alla membrana lipidica di dimensioni nanometriche che sono classificate in base alle loro dimensioni: ectosomi (100-500 nm) ed esosomi (50-150 nm)1. Gli EV contengono varie biomolecole, come proteine, acidi nucleici e lipidi. Queste biomolecole provengono dalle cellule prima di essere incapsulate come carico e rilasciate nello spazio extracellulare tramite EV1,2,3.
A causa della varietà del loro carico, si ritiene che i veicoli elettrici svolgano un ruolo attiv....
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Protocollo
1. Isolamento EV ed etichettatura EV immuno-fluorescente su chip
- Raccolta di terreni di coltura cellulare (CCM) e pre-elaborazione di CCM per l'isolamento EV
- Semina cellule PC3 al 30% di confluenza in un pallone di coltura cellulare di 75 cm2 . Consentire alle cellule di controllo di crescere fino al 90% di confluenza (~ 48 h) nei media standard e negli integratori specifici della linea cellulare.
NOTA: Per evitare che i componenti contenenti EV influenzino l'assorbimento cellulare (ad esempio, siero bovino fetale), utilizzare mezzi e integratori impoveriti di esosomi. - Raccogli il CCM.
- Centrifugare il CCM a 1000 x ....
- Semina cellule PC3 al 30% di confluenza in un pallone di coltura cellulare di 75 cm2 . Consentire alle cellule di controllo di crescere fino al 90% di confluenza (~ 48 h) nei media standard e negli integratori specifici della linea cellulare.
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Risultati
Utilizzando un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione, i veicoli elettrici sono stati isolati dal PC3 CCM ed etichettati con un anticorpo EV-specifico (CD63) coniugato con fluoroforo (Figura 1). I veicoli elettrici etichettati sono stati visualizzati con successo dalla microscopia confocale 3D (Figura 2). I veicoli elettrici etichettati sono stati incubati con cellule per diverse ore in mezzi impoveriti di esosomi. Dopo l'incubazione, le cellule .......
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Discussione
Un test di assorbimento EV basato sull'imaging a fluorescenza 3D tramite microscopia confocale fornisce una metodologia efficiente e un'analisi sensibile. Questa etichettatura fluorescente dei veicoli elettrici facilita la visualizzazione dei veicoli elettrici ed esegue con successo un preciso test di assorbimento dei veicoli elettrici. I metodi precedenti per l'etichettatura dei veicoli elettrici e la rimozione del colorante residuo sono stati segnalati rimuovendo la precipitazione utilizzando l'ultracentrifuga.......
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Dichiarazioni
Y.-K. Cho è un inventore dei brevetti sul dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione, Exodisc, che sono concessi in licenza a Labspinner (Ulsan, Corea). Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da n. di sovvenzione NCI. U54CA143803, CA163124, CA093900 e CA143055 a K. J. P. Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (numero di sovvenzione: HI19C1122). Opera di J. Kim e Y.-K. Cho è stato sostenuto dall'Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finanziato dal governo coreano. Gli autori ringraziano i membri attuali e passati del Brady Urological Institute, in particolare i membri del laboratorio Pienta-Amend, per la lettura critica del manosc....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anticorpo CD63 umano | Biolegend | 353038 | Colorante fluorescente coniugato anticorpo specifico EV |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Reagente di marcatura fluoresent su cellule vive (citoplasma) |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Obiettivo per imaging confocale, NA=1,25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Obiettivo per imaging confocale, NA=0,75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | Un dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione per l'isolamento di veicoli elettrici |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Dispositivo operativo per Exodisc |
| FBS impoverito di esosomi | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutriente dei terreni di coltura cellulare per la raccolta di EV derivate da linee cellulari PC3 |
| Siero fetale bovino (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutriente per la coltivazione cellulare |
| IgG anti-topo di capra H& L abcam preadsorbito | ab7063 | Anticorpo IgG di topo per il controllo negativo della marcatura delle vescicole extracellulari | |
| Ibidi USA U DISH μ-Piatto 35 mm | Ibidi | 81156 | Piatto di coltura per imaging confocale |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Software di elaborazione post-immagine |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 miscelatore di gas Strumento | per cellule vive | TU-O-20 | Sistema incubatore per l'imaging di cellule vive |
| Fotocamera Nikon A1 HD25 / A1R HD25 | Nikon | NA | Fotocamera per imaging confocale |
| Nikon Eclipse Ti Microscopio | Nikon | NA | Microscopio invertito per imaging confocale |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Software di elaborazione delle immagini per microscopio Nikon |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Dispositivo di misurazione per la concentrazione di EV |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Software grafico |
| Penicillina-Streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotici per la coltivazione cellulare |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Terreni di coltura cellulare per la coltivazione di linee cellulari |
| PC3 SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Soluzione in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | Colorante fluorescente per colorazione dell'RNA per la marcatura delle vescicole extracellulari |
Riferimenti
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular ve....
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Ristampe e permessi
