Method Article

Composizione di misurazione del complesso di segnalazione che induce la morte CD95 ed elaborazione della procaspasi-8 in questo complesso

DOI:

10.3791/62842

⸱

August 2nd, 2021

 , 
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui viene presentato un flusso di lavoro sperimentale che consente il rilevamento dell'elaborazione della caspasi-8 direttamente nel complesso di segnalazione che induce la morte (DISC) e determina la composizione di questo complesso. Questa metodologia ha ampie applicazioni, dallo svelamento dei meccanismi molecolari delle vie di morte cellulare alla modellazione dinamica delle reti di apoptosi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'apoptosi estrinseca è mediata dall'attivazione dei recettori di morte (DR) come CD95/Fas/APO-1 o il recettore 1/recettore 2 del ligando che induce l'apoptosi correlata al fattore di necrosi tumorale (TRAIL)-recettore 2 (TRAIL-R1/R2). La stimolazione di questi recettori con i loro ligandi affini porta all'assemblaggio del complesso di segnalazione che induce la morte (DISC). DISC comprende DR, la proteina adattatrice Fas-associated protein with death domain (FADD), procaspasi-8/-10 e proteine enzima-inibitorie cellulari FADD-like (IL)-1β-converting enzyme-inibitory proteins (c-FLIP). Il DISC funge da piattaforma per l'elaborazione e l'attivazione della procaspasi-8. Quest'ultimo avviene attraverso la sua dimerizzazione / oligomerizzazione nei filamenti del dominio effettrice della morte (DED) assemblati al DISC.

L'attivazione della procaspasi-8 è seguita dalla sua elaborazione, che avviene in più passaggi. In questo lavoro, viene descritto un flusso di lavoro sperimentale stabilito che consente la misurazione della formazione di DISC e l'elaborazione della procaspasi-8 in questo complesso. Il flusso di lavoro si basa su tecniche di immunoprecipitazione supportate dall'analisi western blot. Questo flusso di lavoro consente un attento monitoraggio delle diverse fasi del reclutamento della procaspasi-8 al DISC e alla sua elaborazione ed è molto rilevante per lo studio dei meccanismi molecolari dell'apoptosi estrinseca.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uno dei recettori di morte (DR) meglio studiati è CD95 (Fas, APO-1). La via apoptotica estrinseca inizia con l'interazione del DR con il suo ligando affine, cioè CD95L interagisce con CD95 o TRAIL si lega a TRAIL-R. Ciò si traduce nella formazione del DISCO al corrispondente DR. DISC costituito da CD95, FADD, procaspasi-8/-10 e proteine c-FLIP1,2. Inoltre, il DISC è assemblato per interazioni tra proteine contenenti dominio di morte (DD), come CD95 e FADD, e proteine contenenti DED come FADD, procaspasi-8/-10 e c-FLIP (Figura 1). La procaspasi-8 subisce l'oligomerizzazione tramite associazione dei suoi DED, con conseguente formazione di filamenti DED, seguita dall'attivazione e dall'elaborazione della procaspasi-8. Questo innesca una cascata di caspasi, che porta alla morte cellulare (Figura 1)3,4. Pertanto, la procaspasi-8 è una caspasi iniziatrice centrale della via estrinseca dell'apoptosi estrinseca mediata da CD95 o TRAIL-R, attivata alla corrispondente piattaforma macromolecolare, DISC.

Due isoforme di procaspasi-8, vale a dire procaspasi-8a (p55) e -8b (p53), sono note per essere reclutate nel DISC5. Entrambe le isoforme comprendono due DED. DED1 e DED2 si trovano nella parte N-terminale della procaspasi-8a/b seguita dai domini catalitici p18 e p10. L'analisi dettagliata al microscopio crioelettronico (cryo-EM) dei DED della procaspasi-8 ha rivelato l'assemblaggio delle proteine della procaspasi-8 in strutture filamentose chiamate filamenti DED4,6. Sorprendentemente, le catene lineari di procaspasi-8 sono state inizialmente suggerite per essere impegnate nella dimerizzazione seguita dall'attivazione della procaspasi-8 al DISC. Ora, è noto che quelle catene sono solo una sottostruttura del filamento DED procaspasi-8, quest'ultimo composto da tre catene assemblate in una tripla elica3,4,6,7.

Dopo la dimerizzazione al filamento DED, i cambiamenti conformazionali nella procaspasi-8a / b portano alla formazione del centro attivo della procaspasi-8 e alla sua attivazione3,8. Segue la lavorazione della procaspasi-8, che è mediata da due percorsi: il primo passa attraverso la generazione di un prodotto di scissione p43/p41 e il secondo attraverso la generazione iniziale di un prodotto di scissione p30. La via p43/p41 è iniziata dalla scissione della procaspasi-8a/b ad Asp374, con conseguente scissione di p43/p41 e p12 (Figura 2). Inoltre, questi frammenti sono autocatalizzati in asp384 e Asp210/216, dando origine alla formazione dell'eterotetramero attivo caspasi-8, p102/p1829,10,11. Inoltre, è stato dimostrato che in parallelo alla via di lavorazione p43/p41, la procaspasi-8a/b viene scissa anche ad Asp216, il che porta alla formazione del prodotto di scissione C-terminale p30, seguito dalla sua proteolisi a p10 e p1810 (Figura 2).

L'attivazione della procaspasi-8a/b al filamento DED è strettamente regolata da proteine denominate c-FLIP12. Le proteine c-FLIP si trovano in tre isoforme: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS)e c-FLIPRaji (c-FLIPR). Tutte e tre le isoforme contengono dueD nella loro regione N-terminale. c-FLIPL ha anche un dominio C-terminale cataliticamente inattivo simile alla caspasi12,13. Entrambe le isoforme corte di c-FLIP-c-FLIPS e c-FLIPR-agiscono in modo anti-apoptotico interrompendo la formazione di filamenti DED al DISCO6,14,15. Inoltre, c-FLIPL può regolare l'attivazione della caspasi-8 in modo dipendente dalla concentrazione. Ciò può comportare effetti sia pro- che anti-apoptotici16,17,18. Formando l'eterodimero cataliticamente attivo procaspasi-8/c-FLIPL, c-FLIPL porta alla stabilizzazione del centro attivo della procaspasi-8 e alla sua attivazione. La funzione pro- o anti-apoptotica di c-FLIPL dipende direttamente dalla sua quantità ai filamenti DED e dalla successiva quantità di eterodimeri assemblati di procaspasi-8/c-FLIPL 19. Concentrazioni basse o intermedie di c-FLIPL al DISC provocano quantità sufficienti di eterodimeri procaspasi-8/c-FLIPL al filamento DED, che supporta l'attivazione della caspasi-8. Al contrario, l'aumento delle quantità di c-FLIPL porta direttamente ai suoi effetti anti-apoptotici al DISC20.

Nel complesso, l'attivazione e l'elaborazione della procaspasi-8a/b al DISC è un processo altamente regolamentato che coinvolge diverse fasi. Questo documento discute la misurazione dell'elaborazione della procaspasi-8 direttamente sul DISC e l'analisi della composizione di questo complesso. Questo sarà presentato utilizzando CD95 DISC come complesso DR esemplare.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli esperimenti sulle cellule T sono stati eseguiti secondo l'accordo etico 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparare le cellule per l'esperimento

NOTA: Il numero medio di cellule per questa immunoprecipitazione è 1 × 107. Le cellule aderenti devono essere seminate un giorno prima dell'esperimento in modo che ci siano 1 × 107 cellule il giorno dell'esperimento.

  1. Preparazione delle cellule aderenti per l'esperimento
    1. Seme 5-8 × 106 cellule aderenti in 20 ml di mezzo (vedi la tabella dei materiali per la composizione) per ogni condizione in piatti da 14,5 cm un giorno prima dell'inizio dell'esperimento.
    2. Il giorno dell'esperimento, assicurarsi che le cellule siano confluenti all'80-90% e aderenti al piatto. Scartare il mezzo e aggiungere mezzo fresco alle cellule aderenti.
  2. Preparazione delle celle di sospensione per l'esperimento
    1. Posizionare con attenzione 1 × 107 celle di sospensione in 10 ml di terreno di coltura (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) per condizione in piatti da 14,5 cm immediatamente prima dell'inizio dell'esperimento.
    2. Se si utilizzano cellule primarie, isolare le cellule T primarie secondo la procedura precedentemente descritta21. Trattare le cellule T primarie con 1 μg/mL di fitoemoagglutinina per 24 ore, seguite da 25 U/mL di trattamento IL2 per 6 giorni.
    3. Posizionare con attenzione 1 × 108 cellule T primarie in 10 ml di terreno di coltura (vedere la tabella dei materiali per la composizione) per condizione in piatti da 14,5 cm immediatamente prima dell'inizio dell'esperimento.
      NOTA: si raccomanda questo numero maggiore di cellule T primarie, poiché queste cellule sono più piccole.

2. Stimolazione CD95L

  1. Stimolare le cellule con CD95L (prodotto come descritto in precedenza20 o disponibile in commercio (vedi la Tabella dei materiali)).
    NOTA: La concentrazione del CD95L e il tempo di stimolazione dipendono dal tipo cellulare13,15,22,23,24,25. Preparare una condizione di stimolazione due volte per generare un campione di "controllo delle perline" in parallelo.
    1. Stimolare le cellule aderenti con la concentrazione selezionata di CD95L. Tenere la piastra ad angolo e pipettare il ligando nel mezzo senza toccare le cellule aderenti.
    2. Stimolare le cellule in sospensione con CD95L pipettando la soluzione di ligando nella sospensione cellulare.

3. Raccolta cellulare e lisi

  1. Mettere le piastre cellulari sul ghiaccio.
    NOTA: non scartare il supporto. Le cellule morenti galleggiano nel mezzo e sono importanti per l'analisi.
  2. Aggiungere 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) alla sospensione cellulare e raschiare le cellule attaccate dalla piastra. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml.
  3. Lavare la capsula cellulare con 10 mL di PBS freddo due volte e posizionare la soluzione di lavaggio nello stesso tubo da 50 ml. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C.
  4. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 1 mL di PBS freddo. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml.
  5. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 1 mL di PBS freddo.
  6. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 1 mL di tampone di lisi (contenente il 4% di cocktail inibitore della proteasi). Incubarlo per 30 minuti sul ghiaccio.
  7. Centrifugare il lisato alla massima velocità (~17.000 × g)per 15 min, 4 °C.
  8. Trasferire il surnatante (lisato) in un tubo pulito. Scartare il pellet. Prendere 50 μL del lisato in un altro tubo. Analizzare la concentrazione proteica mediante il test bradford e prelevare la quantità di lisato corrispondente a 25 μg di proteine in una fiala. Aggiungere il buffer di carico (vedere la tabella dei materiali per la composizione) al flaconcino. Conservare a -20 °C come controllo lisato.

4. Immunoprecipitazione (IP)

  1. Aggiungere 2 μL di anticorpi anti-APO-1 e 10 μL di perline di sefarosio della proteina A (preparate come raccomandato dal produttore) al lisato. Aggiungere solo 10 μL di perline a un tubo separato contenente lisato (campione stimolato) per generare un "controllo delle perline".
    NOTA: utilizzare punte di pipetta con orifizi larghi tagliando le punte o acquistando punte speciali per IP durante la manipolazione delle perle di sefarosio della proteina A.
  2. Incubare la miscela di lisato con anticorpi/perline di sefarosio della proteina A con una miscelazione delicata durante la notte a 4 °C. Centrifugare i lisati con anticorpi/proteine A perline di sefarosio a 500 × g per 4 min, 4 °C. Scartare il surnatante, aggiungere 1 ml di PBS freddo alle perline e ripetere questo passaggio almeno tre volte.
  3. Scartare il surnatante. Aspirare le perline preferibilmente con una siringa Hamilton da 50 μL.

5. Macchia occidentale

  1. Aggiungere 20 μL di tampone di carico 4x (vedere la tabella dei materiali per la composizione) alle perline e riscaldare a 95 °C per 10 min. Riscaldare i controlli lisati a 95 °C per 5 min.
  2. Caricare i lisati, gli IP e uno standard proteico su un gel di dodecil solfato di sodio (SDS) al 12,5% (vedere la tabella dei materiali per la preparazione del gel) ed eseguire con una tensione costante di 80 V.
  3. Trasferire le proteine dal gel SDS a una membrana di nitrocellulosa.
    NOTA: Qui, la tecnica semi-secca, ottimizzata per le proteine di interesse, è stata utilizzata per il trasferimento oltre 12 min (25 V; 2,5 A = costante). Immergere la membrana di nitrocellulosa e due pile di trasferimento mini-size nel tampone di elettroforesi (vedere la tabella dei materiali per la composizione, preparare secondo le istruzioni del produttore) per alcuni minuti prima del western blotting.
  4. Posizionare la membrana cancellata in una scatola e bloccarla per 1 ora in soluzione bloccante (0,1% Tween-20 in PBS (PBST) + 5% latte). Incubare la membrana con la soluzione bloccante sotto agitazione delicata.
  5. Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.

6. Rilevamento western blot

  1. Aggiungere il primo anticorpo primario alla diluizione indicata (vedere la Tabella dei materiali)alla membrana e incubarlo durante la notte a 4 °C con una delicata agitazione.
  2. Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.
  3. Incubare la membrana con 20 ml di anticorpo secondario (diluito 1:10.000 in PBST + 5% latte) con un delicato scuotimento per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.
  5. Eliminare pbST e aggiungere circa 1 mL di substrato di perossidasi di rafano alla membrana.
  6. Rilevare il segnale chemioluminescente (vedi la Tabella dei Materiali).
    NOTA: Il tempo di esposizione e il numero di immagini catturate dipendono dalla quantità di proteine nella cellula e dalla specificità degli anticorpi utilizzati. Deve essere stabilito empiricamente per ciascun anticorpo utilizzato per la rilevazione.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per analizzare il reclutamento della caspasi-8 nel DISC e la sua elaborazione nel CD95 DISC, questo documento descrive un flusso di lavoro classico, che combina l'IP del CD95 DISC con l'analisi western blot. Ciò consente il rilevamento di diverse caratteristiche chiave dell'attivazione della caspasi-8 al DISC: l'assemblaggio della piattaforma macromolecolare attivante la caspasi-8, il reclutamento della procaspasi-8 al DISC e l'elaborazione di questa caspasi iniziatore (Figura 1 e

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo approccio è stato descritto per la prima volta da Kischkel et al.27 e da allora è stato sviluppato con successo da diversi gruppi. Diverse questioni importanti devono essere considerate per un'efficiente elaborazione disc-immunoprecipitazione e monitoraggio della caspasi-8 in questo complesso.

In primo luogo, è essenziale seguire tutte le fasi di lavaggio durante l'immunoprecipitazione. Particolarmente importanti sono le fasi finali di lavaggio delle perle di sef...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo la Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), il Center of Dynamic Systems (CDS), finanziato dal programma UE FESR (Fondo europeo di sviluppo regionale) e dal DFG (LA 2386) per sostenere il nostro lavoro. Ringraziamo Karina Guttek per aver supportato i nostri esperimenti. Riconosciamo il Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburgo) per averci fornito cellule T primarie.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12,5% gel SDSautoprodottoper due gel separatori:
3,28 mL di H2O
2,5 mL di Tris; pH 8,8; 1,5 M
4,06 mL di acrilammide
100 &; L 10% SDS
100 µ L 10% APS
7.5 µ L TEMED

per due gel di raccolta:
3,1 mL di H2O
1,25 mL di Tris; pH 6,8; 1,5 M
0,5 mL di acrilammide
50 µ L 10% SDS
25 µ L 10% APS
7.5 µ Piastre cellulari L TEMED
da 14,5 cmGreiner639160
acrilammideCarl RothA124.1
Puntali per pipette con filtro ad alto recupero e ampio orifizioVWR46620-664 (Nord America) o 732-0559 (Europa)Utilizzato per pipettare le perle al lisato
anti-actina AbSigma AldrichA2103diluizione: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Abfornito in questi esperimenti dal Prof. P. Krammer o acquistabile da EnzoALX-805-038-C100utilizzato solo per l'immunoprecipitazione
anti-caspasi-10 AbBiozolMBL-M059-3diluizione: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspasi-3 Absegnalazione cellulare9662 Sdiluizione: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspasi-8 Ab C15fornito in questi esperimenti dal Prof. P. Krammer o può essere acquistato da ENZOALX-804-242-C100diluizione: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715diluizione: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Abfornito in questi esperimenti dal Prof. P. Krammer o può essere acquistato da ENZOALX-804-961-0100diluizione: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Abfornito in questi esperimenti dal Prof. P. Krammer o acquistabile da ENZOADI-AAM-212-Ediluizione: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
>anti-PARP Abcell signaling9542diluizione: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APSCarl Roth9592.3
β-mercaptoetanoloCarl Roth4227.2
Soluzione di Bradford
Concentrato di reagente colorante per saggi proteici 450ml		Bio Rad500-0006utilizzato secondo le istruzioni del produttore
CD95Lfornite in questi esperimenti dal Prof. P. Krammer o può essere acquistato da ENZOALX-522-020-C005
rivelatore di chemioluminescenza
Chem Doc XRS+		Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)Sigma Aldrich11 836 145 001preparato secondo le istruzioni del produttore
DPBS (10x) senza Ca, MgPAN BiotechP04-53500diluizione 1:10 con H2O, conservazione in frigorifero
tampone per elettroforesiautoprodotto10x tampone per elettroforesi:
60,6 g Tris
288 g glicina
20 g SDS
ad 2 L H2O
diluizione 1:10 prima dell'uso
glicinaCarl Roth3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05diluizione 1:10.000 in PBST + 5%
latte Goat Anti-Mouse IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05diluizione 1:10.000 in PBST + 5% latte
Capra Anti-coniglio IgG-HRPSouthernBiotech4030-05diluizione 1:10.000 in PBST + 5% latte
Interleuchina-2 Umano(hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001per l'attivazione delle cellule T
KClCarl Roth6781.2
KH2PO4Carl Roth3904.1
tampone di caricamento
4x tampone per campioni Laemmli, 10 mL		Bio Rad161-0747preparato secondo le istruzioni del produttore
Substrato Luminata Forte Western HRPMilliporeWBLUFO500
tampone di lisiautoprodotto13,3 mL Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M
27,5 mL NaCl; 5 M
10 mL EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
aggiungere 960 mL H2O
terreno per cellule adiuvanti DMEM F12 (1:1) con glutammina stabile,  2.438 g/LPAN BiotechP04-41154aggiungendo il 10% di FCS, l'1% di penicillina-streptomicina e lo 0,0001% di puromicina al terreno
medio per le cellule T primariegibco di Life Technologie21875034aggiungendo il 10% di FCS e l'1% di penicillina-streptomicina al latte in
polvereCarl RothT145.4
Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTautoprodotto20x PBST:
230 g NaCl
8 g KCl
56,8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 mL Tween-20
ad 2 L H2O
diluizione 1:20 prima dell'uso
PBST + 5% di latteautoprodotto50 g di latte in polvere + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801per l'attivazione delle cellule T
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373Utilizzare tra 3-5 & micro; Perline di
Sepharose CL-4BNovodirect / Th.GeyerGE 17-0780-01perle di resina di affinità preparate secondo le istruzioni del produttore
raschiettoVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
shakerHeidolph
sodio azideCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo mini-size pile di trasferimentoBio Rad170-4270utilizzato secondo le istruzioni del produttore
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferBio Rad10026938preparato secondo le istruzioni del produttore
TransBlot Turbo Mini-size membrana in nictrocellulosaBio Rad170-4270usato secondo le istruzioni del produttore
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000
medio proteina L

References

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