Fluorescenza in tempo reale, imaging inverso dell'arruffamento cellulare e macropinocitosi

Sommario

Questo protocollo dimostra l'imaging del destrano in cellule vive utilizzando l'assorbimento continuo e immagini inverse per ottimizzare la visualizzazione dell'arricciamento, la maturazione dei macropinosomi e l'analisi del destrano e di altre marcature cellulari.

Abstract

La macropinocitosi è un processo altamente conservato, ma ancora non completamente compreso, essenziale per l'assorbimento e l'ingestione di fluidi, nutrienti in fase fluida e altro materiale nelle cellule. La drammatica estensione delle increspature della superficie cellulare, la loro chiusura per formare macropinosomi e la maturazione dei macropinosomi internalizzati sono eventi chiave in questo percorso che possono essere difficili da catturare utilizzando l'imaging confocale convenzionale basato sul tracciamento di un bolo di carico fluorescente. I destroni fluorescenti sono comunemente usati sperimentalmente come marcatori di fase fluida per i macropinosomi e per altre vie endocitiche. Un metodo che il laboratorio ha adottato per ottimizzare l'imaging dell'assorbimento del destrano prevede l'utilizzo di immagini dal vivo di cellule immerse in alte concentrazioni di destrano fluorescente nel mezzo, con le cellule non marcate che appaiono in rilievo (come nere). Le increspature cellulari sono evidenziate per visualizzare la chiusura delle increspature e i macropinosomi internalizzati appaiono come vacuoli fluorescenti all'interno della cellula. Questo metodo è ottimale per visualizzare le caratteristiche dei macropinosomi e consente una facile segmentazione e quantificazione. Questo articolo descrive la doppia marcatura di percorsi con destrani di diverse dimensioni e la co-espressione di sonde lipidiche e proteine fluorescenti di membrana per marcare macropinosomi e altri endosomi. È stata inoltre dimostrata la rilevazione del destrano internalizzato a livello ultrastrutturale mediante microscopia elettronica e ottica correlativa (CLEM). Questi processi cellulari possono essere riprodotti utilizzando diverse modalità di imaging dal vivo, anche in 3D. Nel loro insieme, questi approcci ottimizzano l'imaging dei macropinosomi per molti contesti e sistemi sperimentali diversi.

Introduzione

La maggior parte dei tipi di cellule vertebrate condivide la capacità innata di assorbire non selettivamente il fluido con i predecessori nel corso dell'evoluzione, risalenti all'ameba unicellulare¹. Questo processo altamente conservato di assorbimento della fase fluida da parte della macropinocitosi (big drinking) è utilizzato dall'ameba principalmente per l'acquisizione di nutrienti¹, mentre nelle cellule dei vertebrati può essere una via di rifornimento per ottenere nutrienti sotto stress, ed è utilizzato dalle cellule immunitarie per il campionamento e la sorveglianza degli ambienti ....

Protocollo

1. Preparazione delle celle su piastre con fondo di vetro da 35 mm (Giorno 0)

1. Mantenere e far passare le linee cellulari in terreno completo integrato con siero di vitello fetale inattivato al 10% (per RAW264.7) o normale e L-glutammina all'1%, a 37 °C in incubatore umidificato al 5% di CO₂ .
2. Piastra il numero appropriato di celle per ottenere una confluenza del 60% in 24 ore, su piastre con fondo di vetro da 35 mm.
   NOTA: La densità cellulare raccomandata è compresa tra 2 mL di 0,15 x 10⁶ cellule/mL e 0,25 x 10⁶ cellule/mL per le cellule microgliali RAW264.7, BV2 e MDA-MB 231 q....

Risultati

L'approccio di imaging di cellule vive non marcate immerse in un'alta concentrazione di destrano fluorescente presenta diversi vantaggi rispetto alle tecniche di imaging convenzionali per il monitoraggio della macropinocitosi. Presentando le immagini in rilievo, i corpi cellulari appaiono neri e consentono una migliore visualizzazione della drammatica superficie cellulare che si increspa su uno sfondo luminoso e fluorescente, seguita dall'internalizzazione in fase fluida dei macropinosomi riempiti di destrano TMR (70 kDa.......

Discussione

Questo articolo descrive le variazioni sui modi più tradizionali di utilizzare l'etichettatura del destrano per monitorare la macropinocitosi, sulla base dell'imaging dal vivo di cellule immerse continuamente in destrano fluorescente e visualizzando l'assorbimento sullo sfondo nero di cellule non marcate. Il protocollo ottimizzato fornisce i mezzi per distinguere tra diverse vescicole intracellulari e consente un tracciamento spazio-temporale di molteplici carichi e proteine macropinocit.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tetrossido di osmio al 2%	ProSciTech	EMS19192
647-Sonde molecolari della transferrina	, Invitrogen	Cellule T23366
BV2	Dono gentilmente offerto dal Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)	-
CpG (Classe B) B	Integrated DNA Technologies Ordine
Destrano Alexa Fluor 488  a 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22910
Destrano Alexa Fluor 647  a 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22914
Destrano Oregon Green 488 a 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D1818
Destrano Tetrametilrodamina a 70 kDa MW Life	Technology Australia Pty Ltd	D7173
DMEM medium con piruvato di sodio e L-glutammina	Gibco Invitrogen	#11995
Siero fetale di vitello	Interpath Services Pty Ltd	SFBS-F
Soluzione acquosa di glutaraldeide, grado EM 25%	ProSciTech	C002
Jeol 1011 microscopio elettronico
	Gibco Invitrogen	25030081
Lipofectamina 2000	Gibco Invitrogen	11668019
MatTek  Piatto con fondo in vetro 35 mm, griglia non rivestita	MatTek Corporation	P35G-2-14-CGRD
Piastre con fondo in vetro MatTek 35 mm non rivestito	MatTek Corporation	P35G-1.5-14C
MDA-MB 231 celle	ATCC	HTB-26
Opti-MEM a siero ridotto Thermo	Fisher Scientific	31985088
Plasmid mCherry-2XFYVE	Dono gentilmente dato a noi dal Dr Frederic Meunier (Università del Queensland)	-
Plasmide mCherry-PLCδ-PH	Dono gentilmente dato a noi dal Dr Frederic Meunier (Università del Queensland)	-
Raw264.7 cellule	ATCC	TIB-71
RPMI medium 1640, senza L-glutammina	Gibco Invitrogen	# 21870
Ultrapure LPS	Jomar Life Research Pte Ltd	TLR-3PELPS
Acetato di uranile	ProSciTech	C079
Microscopio confocale invertito Zeiss LSM880	Zeiss	-

personalizzato JEOL-L-Glutammina