Questo protocollo descrive un approccio efficiente e riproducibile per gli studi istologici sul cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging.
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Articolo metodologico
Immunocolorazione fluttuante del cervello di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La colorazione immunoistochimica del cervello dei topi è una tecnica di routine comunemente usata nelle neuroscienze per studiare i meccanismi centrali alla base della regolazione del metabolismo energetico e di altri processi neurobiologici. Tuttavia, la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati dell'istologia cerebrale possono variare tra i laboratori. Per ogni esperimento di colorazione, è necessario ottimizzare le procedure chiave in base alle differenze di specie, tessuti, proteine mirate e condizioni di lavoro dei reagenti. Questo documento dimostra un flusso di lavoro affidabile in dettaglio, tra cui perfusione intra-aortica, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging, che può essere seguito facilmente dai ricercatori in questo campo.
Sono inoltre discussi come modificare queste procedure per soddisfare le esigenze individuali dei ricercatori. Per illustrare l'affidabilità e l'efficienza di questo protocollo, le reti perineuronali sono state colorate con Listeria florbunda agglutinina (WFA) marcata con biotina e arginina vasopressina (AVP) con un anticorpo anti-AVP nel cervello del topo. Infine, sono stati affrontati i dettagli critici per l'intera procedura e i vantaggi di questo protocollo rispetto a quelli di altri protocolli. Nel complesso, questo documento presenta un protocollo ottimizzato per l'immunocolorazione fluttuante del tessuto cerebrale del topo. Seguire questo protocollo rende questo processo più facile sia per gli scienziati junior che senior per migliorare la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità degli studi di immunocolorazione.
Introduzione
La prevalenza dell'obesità e delle comorbidità associate ha raggiunto livelli epidemici, causando un enorme onere socioeconomico1,2. Sono stati sviluppati vari modelli murini per comprendere meglio i processi biologici responsabili dell'obesità3,4. Poiché i meccanismi centrali sono importanti per la regolazione dell'omeostasi energetica in questi modelli animali, gli studi neuroanatomici sul cervello dei topi sono diventati una tecnica necessaria in questo campo. Tuttavia, la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità delle tecniche di istologia cere....
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Protocollo
Topi C57BL/6J di entrambi i sessi (8-16 settimane di età) sono stati utilizzati nel presente studio. La cura di tutti gli animali e tutte le procedure sono state approvate dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali del Baylor College of Medicine.
1. Perfusione
NOTA: i passaggi da 1.1 a 1.6 vengono eseguiti in una cappa aspirante.
- Anestesia
- Versare 5 ml di isoflurano (vedi la Tabella dei materiali) su un tovagliolo di carta posto sul fondo di un essiccatore. Introdurre il mouse sulla barriera forata all'interno dell'essiccatore e attendere che i....
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Risultati
Il diagramma di flusso di questo protocollo è brevemente illustrato nella Figura 1. La procedura di criosezione di questo laboratorio è dimostrata nella Figura 2A, in cui sono stati sezionati contemporaneamente 5 campioni di cervello. Il montaggio delle sezioni cerebrali è mostrato nella Figura 2B e una diapositiva completamente montata con sezioni cerebrali è illustrata nella Figura 2C. Nella
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Discussione
Questo protocollo fornisce un metodo consolidato per studi neuroanatomici del cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento dei tessuti, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging. Tuttavia, alcuni dettagli chiave essenziali per risultati coerenti e affidabili devono essere ottimizzati.
La qualità della perfusione è fondamentale per una colorazione di successo. I risultati della colorazione potrebbero essere influenzati se il sangue rimane nel cervello, dato che le cel.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Gli investigatori sono stati supportati da sovvenzioni del NIH (K01DK119471 a CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 e R01DK120858 a YX), USDA/CRIS (51000-064-01S a YX) e American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) a LT.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alexa Farina 594 asino anti-coniglio IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% saccarosio | VWR | 470302 | 30 g di saccarosio svuotato in 100 ml di PBS |
| Formalina tamponata neutra | VWR | 16004-128 | 10%, 25 gradi C, pH 6,8-7,2 |
| Siringa Sub-Q da 1 mL | BD | 309597 | |
| Piastra per colture cellulari a 48 pozzetti | Corning | 3548 | |
| Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti | Corning | 3516 | |
| Terreni di montaggio antisbiadimento con essiccatore in plastica autoclavabile DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | ||
| Anticorpo AVP | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Filtro cellulare | Corning | 431752 | |
| Tampone crioprotettore | Preferenza dell'utente | Non applicabile | 20% glicerolo, 30% glicole etilenico e 50% PBS |
| Isoflurano | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscopio | Leica | Non applicabile | |
| Scatole per vetrini per microscopio (50 posti) | VWR | Non applicabile | |
| PBT | Preferenza dell'utente | Non applicabile | 2,5 mL di Triton X-100 disciolto in 1000 mL di |
| PBS Perfusion due sistemi di perfusione automatizzati | Leica | 39471005 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 gradi; C, pH 7,3-7,5, 1x composizione:137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,8 mM Tampone fosfato |
| Microtomo scorrevole Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Cloruro di sodio | RICCA Chemical | 7220-32 | 0,9%, 25 gradi; C, pH 7.4 |
| Proteina streptavidina, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| Anticorpo WFA | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Non applicabile | |
| 3.1 software | scanner |
Riferimenti
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The Am....
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Ristampe e permessi
