Articolo metodologico

Immunocolorazione fluttuante del cervello di topo

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DOI:

10.3791/62876

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7 ottobre 2021

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1USDA/ARS Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of Endocrinology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Hubei Provincial Clinical Research Center for Diabetes and Metabolic Disorder, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un approccio efficiente e riproducibile per gli studi istologici sul cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging.

Abstract

La colorazione immunoistochimica del cervello dei topi è una tecnica di routine comunemente usata nelle neuroscienze per studiare i meccanismi centrali alla base della regolazione del metabolismo energetico e di altri processi neurobiologici. Tuttavia, la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati dell'istologia cerebrale possono variare tra i laboratori. Per ogni esperimento di colorazione, è necessario ottimizzare le procedure chiave in base alle differenze di specie, tessuti, proteine mirate e condizioni di lavoro dei reagenti. Questo documento dimostra un flusso di lavoro affidabile in dettaglio, tra cui perfusione intra-aortica, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging, che può essere seguito facilmente dai ricercatori in questo campo.

Sono inoltre discussi come modificare queste procedure per soddisfare le esigenze individuali dei ricercatori. Per illustrare l'affidabilità e l'efficienza di questo protocollo, le reti perineuronali sono state colorate con Listeria florbunda agglutinina (WFA) marcata con biotina e arginina vasopressina (AVP) con un anticorpo anti-AVP nel cervello del topo. Infine, sono stati affrontati i dettagli critici per l'intera procedura e i vantaggi di questo protocollo rispetto a quelli di altri protocolli. Nel complesso, questo documento presenta un protocollo ottimizzato per l'immunocolorazione fluttuante del tessuto cerebrale del topo. Seguire questo protocollo rende questo processo più facile sia per gli scienziati junior che senior per migliorare la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità degli studi di immunocolorazione.

Introduzione

La prevalenza dell'obesità e delle comorbidità associate ha raggiunto livelli epidemici, causando un enorme onere socioeconomico1,2. Sono stati sviluppati vari modelli murini per comprendere meglio i processi biologici responsabili dell'obesità3,4. Poiché i meccanismi centrali sono importanti per la regolazione dell'omeostasi energetica in questi modelli animali, gli studi neuroanatomici sul cervello dei topi sono diventati una tecnica necessaria in questo campo. Tuttavia, la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità delle tecniche di istologia cerebrale variano considerevolmente tra i laboratori e persino i ricercatori all'interno dello stesso laboratorio per vari motivi (ad esempio, anticorpi, tessuti, trattamenti, specie, obiettivi di ricerca). Pertanto, è necessario stabilire un protocollo generale per gli studi istologici del cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging. Nel frattempo, i principianti possono imparare, padroneggiare e regolare rapidamente questo protocollo per soddisfare le loro esigenze individuali.

La colorazione immunoistochimica è un metodo consolidato che è stato ampiamente utilizzato per visualizzare specifici tipi di cellule, mRNA e proteine in una varietà di tessuti (ad esempio, cervello e tessuti periferici)5,6. Più specificamente, un antigene di interesse può essere etichettato da uno specifico anticorpo primario e da un corrispondente anticorpo secondario legato a un enzima (ad esempio, immunoistochimica cromogenica) o a un colorante fluorescente (isotiocianato di fluoresceina)6. Come esempio dell'utilità di queste tecniche, β-endorfina [un peptide codificato da pro-opiomelanocortina (POMC)] e c-fos (un marker di attività neuronale) sono stati colorati nel nucleo arcuato. La delezione della triptofano idrossilasi 2 (un enzima parte integrante della sintesi della serotonina) nel nucleo del rafe dorsale ha dimostrato di ridurre l'espressione di c-fos nei neuroni POMC nel nucleo arcuato7. Inoltre, la distribuzione dell'mRNA del recettore della vitamina D è stata mappata nel cervello del topo tramite ibridazione in situ (RNAscope)8. Questo documento presenta un metodo affidabile ed efficiente con un flusso di lavoro passo-passo per l'immunocolorazione fluttuante, con l'obiettivo di migliorare la qualità e la riproducibilità degli studi istologici del cervello del topo.

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Protocollo

Topi C57BL/6J di entrambi i sessi (8-16 settimane di età) sono stati utilizzati nel presente studio. La cura di tutti gli animali e tutte le procedure sono state approvate dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali del Baylor College of Medicine.

1. Perfusione

NOTA: i passaggi da 1.1 a 1.6 vengono eseguiti in una cappa aspirante.

  1. Anestesia
    1. Versare 5 ml di isoflurano (vedi la Tabella dei materiali) su un tovagliolo di carta posto sul fondo di un essiccatore. Introdurre il mouse sulla barriera forata all'interno dell'essiccatore e attendere che i segni di respirazione siano scomparsi.
      NOTA: Senza respirazione, il topo ha ancora battito cardiaco per un breve periodo di tempo e sarà perfuso prima della scomparsa del battito cardiaco.
    2. Prima di procedere, confermare che non vi è alcun riflesso a un pizzico di punta.
    3. Fissare il mouse a una tavola di schiuma guidando un perno attraverso ogni piede. Assicurarsi che il pannello di schiuma sia posto in un vassoio per raccogliere lo spillover liquido.
  2. Esporre il cuore
    1. Fare un'incisione superficiale longitudinale lungo la linea mediana sopra il torace e l'addome, quindi spostare la pelle da parte per esporre la parete muscolare del torace e dell'addome. Quindi, fare un'incisione nello strato muscolare per esporre il fegato e l'intestino. Infine, tagliare la gabbia toracica con le forbici per aprire il torace ed esporre il cuore e i polmoni. Utilizzare una pinza emostatica per tirare da parte la cassa toracica per allargare l'area di lavoro.
  3. Raccolta di sangue terminale (facoltativo)
    1. Inserire una siringa da 1 mL (vedere la Tabella dei materiali) con attenzione nell'atrio destro del cuore fino a quando la punta non è completamente incorporata. Tenere ferma la siringa e prelevare il sangue lentamente fino a raggiungere il volume desiderato.
      NOTA: Fare attenzione a non penetrare oltre l'atrio destro; La raccolta di 300-400 μL di sangue è ottenibile per topo adulto. Possono essere utilizzati additivi come un acceleratore di coaguli o un anticoagulante, a seconda dello scopo della raccolta del sangue.
  4. Posizionamento della cannula di perfusione
    1. Per i principianti, tagliare un piccolo foro (<1 mm) nel ventricolo sinistro del cuore con le forbici e inserire una cannula smussata (ago da 18 G per topi giovani e ago da 21 G per topi anziani) attraverso il ventricolo sinistro nell'aorta ascendente. In alternativa, per gli sperimentatori esperti, penetrare direttamente nel ventricolo cardiaco sinistro con una cannula smussata e inserirla con attenzione nell'aorta ascendente.
    2. Posizionare i perni attorno alla congiunzione della cannula e del tubo accoppiato sul pannello di schiuma per impedire il movimento durante la perfusione. In alternativa, utilizzare una pinza emostatica per fissare la cannula in posizione. Procedere a tagliare l'atrio destro per consentire il deflusso del sangue dalla circolazione.
      NOTA: La cannula di perfusione e il tubo accoppiato sono collegati alla pompa di perfusione.
  5. Perfusione con soluzione salina
    1. Accendere il pressostato salino e perfondere il mouse transcardialmente con 40-60 ml di soluzione salina (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Osservare da vicino il deflusso dall'atrio destro e il colore del fegato.
      NOTA: Una pompa di perfusione automatizzata (vedere la tabella dei materiali) viene utilizzata per lavare il sangue entro 1-2 minuti. Poiché l'intervallo di pressione della pompa è 1-300 mmHg, la velocità può essere regolata di conseguenza. Se la soluzione salina fuoriesce dal naso e / o il polmone è gonfiato, diminuire la pressione e regolare la cannula. Una volta che il deflusso non contiene più sangue, il cervello è sufficientemente arrossato con soluzione salina. Nel frattempo, il fegato è privo di sangue e diventa di colore grigio-brunastro.
  6. Perfusione con formalina
    1. Spegnere il pressostato salino e accendere il pressostato a formalina per perfondere il mouse con 40 ml di formalina tamponata neutra al 10% (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, vedere la Tabella dei materiali). Osserva gli arti dell'animale per prove di tremori.
      NOTA: il movimento della coda può essere osservato anche dopo l'infusione del 10% di NBF. ATTENZIONE: Poiché l'NBF è pericoloso, si suggerisce ai ricercatori di indossare dispositivi di protezione individuale (ad esempio, respiratore appropriato, visiera) durante tutta la procedura.
  7. Isolamento cerebrale9
    1. Usa le forbici per rimuovere la testa. Fai un'incisione della linea di mezzo lungo il tegumento per esporre il cranio. Tagliare la pelle e l'attaccamento muscolare con le forbici.
    2. Fai un taglio sulla cresta orbitale, quindi posiziona l'estremità affilata delle forbici dell'iride nel forame magnum. Far avanzare le forbici lungo la superficie interna del cranio, mantenendo la pressione verso l'alto per evitare danni al cervello. Rimuovere con cura le ossa parietali / frontali e le meningi. Infine, rimuovere delicatamente il cervello dal cranio aperto.
  8. Post-fissazione
    1. Posizionare il cervello in un tubo da 15 ml riempito con 10 mL di NBF al 5% e saccarosio al 15% per la fissazione notturna a 4 °C.
      NOTA: Per preparare 10 mL di 5% NBF e 15% saccarosio, combinare 5 mL di 10% NBF e 5 mL di 30% saccarosio (p/v, disciolto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), vedere la Tabella dei materiali). Assicurarsi che il volume del buffer fissativo sia almeno 10 volte più grande del campione stesso. Inizialmente, il cervello fluttuerà nel buffer e affonderà sul fondo dopo la fissazione notturna.
  9. Disidratazione
    1. Trasferire il campione di cervello in un tubo da 15 ml riempito con 10 mL di saccarosio al 30% per la disidratazione a 4 °C fino a quando non affonda.

2. Criosezione (sezioni coronali)

  1. Preparazione
    1. Posizionare il ghiaccio secco sopra la piastra di regolazione dell'altezza di un microtomo scorrevole e attendere che il gelo bianco sia visibile. Stendere con cura 5 ml di saccarosio al 30% sulla parte superiore della piastra per formare uno strato di una base solida dopo che la soluzione di saccarosio è completamente congelata. Posizionare tutti i campioni di cervello (fino a 5 campioni di cervello in un lotto) orizzontalmente in una linea sopra il saccarosio, quindi aggiungere 0,5 ml di saccarosio al 30% sul fondo di ciascun cervello.
      NOTA: Il cervello si attaccherà immediatamente alla base di saccarosio congelato e gradualmente si congelerà dal basso verso l'alto. Posizionare ulteriore saccarosio attorno alla parte montata del cervello per formare una base più robusta per il taglio.
  2. Taglio
    1. Dopo 5-10 minuti di congelamento, quando il cervello è diventato duro e bianco, tagliare il cervello fino a raggiungere lo strato / regione desiderata.
      NOTA: Regolare la quantità di ghiaccio secco sulla piastra per controllare la temperatura. La temperatura è troppo bassa quando i cristalli di ghiaccio appaiono sulla superficie del cervello. La temperatura è troppo alta quando il cervello diventa morbido e non è più bianco.
    2. Passare dalla modalità Trim alla modalità Feed e sezionare il tessuto cerebrale a 25 μm di spessore. Preparare una piastra a 48 pozzetti riempita con 1x PBS e contrassegnare cinque pozzetti per un cervello di topo. Usa un pennello per raccogliere ogni sezione da un mouse e posizionarla in un pozzetto. Raccogli la sezione successiva dello stesso mouse e posizionala nel 2 ° pozzo.
    3. Ripetere 2.2.2 fino a raggiungere il 5 ° pozzo, posizionando le sezioni 6-10 nel 1 ° -5 ° pozzo e così via. Ripeti la stessa procedura per il resto del cervello contemporaneamente. Ripetere fino a quando tutte le sezioni di un topo sono raccolte nei 5 pozzetti in ordine anatomico.
      NOTA: Seguendo questa procedura, le sezioni cerebrali di ciascun topo vengono aliquotate in 5 serie, che possono essere utilizzate per un massimo di 5 diversi studi istologici.
  3. Immagazzinamento
    1. Utilizzare un pennello per trasferire le sezioni da ciascun pozzetto a un microtubo da 1,5 ml riempito con tampone crioprotettivo (20% glicerolo, 30% glicole etilenico e 50% PBS) e conservare i campioni a -20 °C.
      NOTA: queste sezioni conservate in piccoli tubi (1,5 ml) possono risparmiare spazio fisico nel congelatore e l'integrità delle sezioni può essere conservata per diversi mesi.

3. Colorazione WFA fluttuante e immunocolorazione anti-AVP

  1. Posizionare un colino cellulare in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti piena di PBS e utilizzare un pennello per trasferire una serie di sezioni cerebrali nel filtro cellulare. Risciacquare le sezioni in PBS trasferendo il filtro cellulare in un altro pozzo pieno di PBS. Risciacquare per 6 x 10 minuti su uno shaker per le sezioni conservate in tampone crioprotettivo e 3 x 10 minuti per le sezioni appena tagliate.
    NOTA: Tutte le procedure di lavaggio vengono eseguite in una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con un filtro cellulare all'interno di ciascun pozzetto (vedere la Tabella dei materiali). Ogni colino contiene le sezioni cerebrali di interesse di ciascun topo. Per risparmiare i reagenti, tutte le procedure di incubazione descritte di seguito vengono eseguite in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Tra le procedure di lavaggio e incubazione, utilizzare un pennello per trasferire le sezioni cerebrali tra ciascun colino cellulare e ciascun tubo. Per il lavaggio con PBS, 12 ml sono adeguati per ogni pozzetto.
  2. Preparare 1 mL di soluzione WFA (1:1.000) marcata con biotina in tampone PBT (2,5 mL di Triton X-100 disciolto in 1.000 mL di PBS) in tubo da 1,5 mL. Trasferire le sezioni cerebrali dal filtro cellulare al tubo e incubare a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo ~ 50 giri / min durante la notte.
  3. Risciacquare le sezioni cerebrali con PBS per 3 x 10 minuti come descritto in 3.1.
  4. Preparare 1 mL di soluzione di streptavidina-Dylight 488 (1:500) in PBT in un tubo da 1,5 mL. Trasferire le sezioni cerebrali nel tubo e incubare a temperatura ambiente per 2 ore su una piattaforma a dondolo a ~ 50 giri / min.
    NOTA: Coprire la piastra con un foglio per evitare l'esposizione alla luce da questo passo in avanti.
  5. Risciacquare le sezioni cerebrali con PBS per 3 x 10 min. Incubare le sezioni cerebrali in tampone bloccante (3% di siero d'asino normale diluito in PBT) per 2 ore a temperatura ambiente.
    NOTA: La scelta del siero bloccante è determinata dalla specie da cui viene generato l'anticorpo secondario. ad esempio, se l'anticorpo secondario proviene da capra, deve essere usato il normale siero di capra.
  6. Incubare le sezioni cerebrali in anticorpi primari (coniglio anti-AVP, 1:500) a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante a ~ 50 giri / min durante la notte.
    NOTA: Preparare sia gli anticorpi primari che quelli secondari nel tampone di blocco. La concentrazione, la durata dell'incubazione e la temperatura di incubazione devono essere ottimizzate negli studi pilota.
  7. Risciacquare le sezioni cerebrali con PBS per 3 x 10 min. Incubare le sezioni cerebrali in anticorpi secondari (Alexa Flour 594 asino anti-coniglio IgG (H + L), 1: 500) a temperatura ambiente per 2 ore su una piattaforma a dondolo a ~ 50 giri / min. Risciacquare le sezioni cerebrali con PBS per 3 x 10 min.

4. Montaggio

  1. Riempire due piastre di Petri (un diametro di 150 mm) con 100 ml di 1x PBS ciascuna. Trasferire tutte le sezioni cerebrali da un colino al primo piatto e allineare le sezioni cerebrali in ordine neuroanatomico da caudale a rostrale.
    NOTA: per evitare di mescolare sezioni di animali diversi, montare una serie di sezioni cerebrali da un animale alla volta.
  2. Dopo che tutte le sezioni cerebrali sono allineate nel primo piatto, immergere un vetrino nel secondo piatto con un'estremità leggermente inclinata con un supporto (vedere Figura 1 e Figura 2). Usa un pennello sottile per posizionare delicatamente una sezione del cervello appena sotto l'interfaccia del buffer d'aria sulla diapositiva inclinata. Ripeti la stessa procedura con un'altra sezione cerebrale e montala fianco a fianco con la prima sezione.
  3. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere lentamente e delicatamente il buffer per abbassarne il livello fino a quando entrambe le sezioni cerebrali sono completamente sopra l'interfaccia air-buffer.
    NOTA: Fare attenzione a ridurre al minimo il disturbo della superficie tampone, o le sezioni cerebrali possono galleggiare via. Quando è asciutto, questa fila di sezioni cerebrali aderirà saldamente alla diapositiva. Se necessario, regolare delicatamente le sezioni sul vetrino per assicurarsi che non ci siano rughe o pieghe nel tessuto quando le sezioni sono ancora bagnate.
  4. Ripetere questo processo fino a raggiungere la parte inferiore della diapositiva. Continuare a ripetere fino a quando tutte le sezioni non sono montate sulle diapositive.

5. Coverslipping

  1. Dopo che tutte le sezioni si sono asciugate (1-24 ore a temperatura ambiente), posizionare 80-100 μL di mezzo di montaggio anti-sbiadimento con DAPI (vedere la tabella dei materiali) sul vetrino e applicare delicatamente una copertura di vetro per coprire i campioni.
    NOTA: Applicare la coverlip in vetro con attenzione e lentamente per evitare bolle.
  2. Posizionare i vetrini in una scatola di vetrini per microscopio (vedere la Tabella dei materiali) e conservarli a 4 °C.
    NOTA: Immagine di tutte le sezioni entro 1-3 giorni per evitare lo sbiadimento della fluorescenza e lo sviluppo dell'autofluorescenza.

6. Imaging

  1. Accendere lo scanner e il computer (vedere Tabella dei materiali). Posizionare le diapositive nel supporto della slitta con il dispositivo di caricamento e inserire il supporto nello scanner.
    NOTA: lo scanner consente la scansione di più canali (ad esempio, 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), canali verdi e rossi) contemporaneamente. Lo scanner scansiona i vetrini solo con un ingrandimento di 20x e un microscopio fluorescente tradizionale (vedi Tabella dei materiali) può essere utilizzato quando è necessario un ingrandimento più elevato (ad esempio, 40x).
  2. Aprire il software per lo scanner (vedere la Tabella dei materiali). Scegliere la posizione di archiviazione e il profilo di scansione appropriati.
  3. Avviare la scansione di anteprima facendo clic sul pulsante Avvia scansione anteprima . Dopo la scansione di anteprima, aprire la procedura guidata di rilevamento dei tessuti e cerchiare le regioni di interesse per l'imaging.
  4. Fare clic sul pulsante Avvia scansione dopo aver scelto le regioni per l'imaging. Attendere che la macchina finisca la scansione. Controlla il file dei risultati ed esporta le immagini.
    NOTA: se il profilo non è adatto alla diapositiva, regolare rifocalizzando e modificando il tempo di esposizione o la forza della luce per adattare il profilo ai tessuti. Fare riferimento alle istruzioni per lo scanner per ulteriori dettagli tecnici (Tabella dei materiali).

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Risultati

Il diagramma di flusso di questo protocollo è brevemente illustrato nella Figura 1. La procedura di criosezione di questo laboratorio è dimostrata nella Figura 2A, in cui sono stati sezionati contemporaneamente 5 campioni di cervello. Il montaggio delle sezioni cerebrali è mostrato nella Figura 2B e una diapositiva completamente montata con sezioni cerebrali è illustrata nella Figura 2C. Nella

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Discussione

Questo protocollo fornisce un metodo consolidato per studi neuroanatomici del cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento dei tessuti, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging. Tuttavia, alcuni dettagli chiave essenziali per risultati coerenti e affidabili devono essere ottimizzati.

La qualità della perfusione è fondamentale per una colorazione di successo. I risultati della colorazione potrebbero essere influenzati se il sangue rimane nel cervello, dato che le cel...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Gli investigatori sono stati supportati da sovvenzioni del NIH (K01DK119471 a CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 e R01DK120858 a YX), USDA/CRIS (51000-064-01S a YX) e American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) a LT.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alexa Farina 594 asino anti-coniglio IgG (H+L)InvitrogenA21207
  30% saccarosioVWR47030230 g di saccarosio svuotato in 100 ml di PBS
Formalina tamponata neutraVWR16004-12810%, 25 gradi C, pH 6,8-7,2
Siringa Sub-Q da 1 mLBD309597
Piastra per colture cellulari a 48 pozzettiCorning3548
Piastra per colture cellulari a 6 pozzettiCorning3516
Terreni di montaggio antisbiadimento con essiccatore in plastica autoclavabile DAPIVector LaboratoriesH-1200
Thermo Scientific Nalgene5315-0150
Anticorpo AVPPhoenix PharmaceuticalsH-065-07
Filtro cellulareCorning431752
Tampone crioprotettorePreferenza dell'utenteNon applicabile20% glicerolo, 30% glicole etilenico e 50% PBS
IsofluranoCovetrus11695-6777-2
Leica DFC310FX microscopioLeicaNon applicabile
Scatole per vetrini per microscopio (50 posti)VWRNon applicabile
PBTPreferenza dell'utenteNon applicabile2,5 mL di Triton X-100 disciolto in 1000 mL di
PBS Perfusion due sistemi di perfusione automatizzatiLeica39471005
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 20xVWRVWRVE703-1L25 gradi; C, pH 7,3-7,5, 1x composizione:137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,8 mM Tampone fosfato
Microtomo scorrevole Microm HM450ThermoFisherMicrom HM450
Cloruro di sodioRICCA Chemical7220-320,9%, 25 gradi; C, pH 7.4
Proteina streptavidina, DyLight 488ThermoFisher#21832
Triton X-100Sigma-Aldrich089k01921
Anticorpo WFASigma-AldrichL1516
Zeiss Axio Z1 ScannerZeissNon applicabile
3.1 softwarescanner
Zen

Riferimenti

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