Identificazione globale delle reti di interazione co-traslazionale mediante profilazione selettiva dei ribosomi

Sommario

Le interazioni co-traslazionali svolgono un ruolo cruciale nelle modifiche della catena nascente, nel targeting, nella piegatura e nei percorsi di assemblaggio. Qui, descriviamo il Selective Ribosome Profiling, un metodo per l'analisi diretta in vivo di queste interazioni nel modello eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Negli ultimi anni, è diventato evidente che i ribosomi non solo decodificano il nostro mRNA, ma guidano anche l'emergere della catena polipeptidica nell'ambiente cellulare affollato. I ribosomi forniscono la piattaforma per il legame controllato spazialmente e cineticamente di fattori di targeting della membrana, enzimi modificanti e chaperoni pieghevoli. Anche l'assemblaggio in complessi oligomerici di alto ordine, così come le fasi di formazione della rete proteina-proteina, sono stati recentemente scoperti per essere coordinati con la sintesi.

Qui, descriviamo il Selective Ribosome Profiling, un metodo sviluppato per catturare le interazioni co-traduzionali in vivo. Descriveremo in dettaglio le varie fasi di purificazione dell'affinità necessarie per catturare complessi ribosomi-catena nascente insieme agli interattori co-traduzionali, nonché l'estrazione dell'mRNA, l'esclusione delle dimensioni, la trascrizione inversa, il sequenziamento profondo e le fasi di analisi dei big data, necessarie per decifrare le interazioni co-traduzionali nella risoluzione quasi codone.

Introduzione

Selective Ribosome Profiling (SeRP) è l'unico metodo, ad oggi, che cattura e caratterizza le interazioni co-traslazionali, in vivo, in modo diretto ^1,2,3,4,5,6. SeRP consente la profilazione globale delle interazioni di qualsiasi fattore con la traduzione dei ribosomi nella risoluzione vicino al codone ^2,7.

Il metodo si basa sul congelamento flash delle cell....

Protocollo

1. Generazione di ceppi per la profilazione selettiva dei ribosomi

NOTA: Selective Ribosome Profiling (SeRP) è un metodo che si basa sulla purificazione dell'affinità dei fattori di interesse, per valutare la loro modalità di interazione con i complessi di catene ribosomi-nascenti. La ricombinazione omologa⁹ e i metodi basati su CRISPR / Cas9¹⁰ vengono utilizzati per fondere vari fattori di interesse con tag per purificazioni di affinità. Tali tag sono GFP, per le purificazioni di affinità GFP-trap, TAP-tag per le purificazioni di perline IgG-Sepharose e AVI-Tag purificato d....

Risultati

Come illustrato nel diagramma di flusso di questo protocollo (Figura 1), le cellule sono state coltivate fino alla fase di log, e poi raccolte rapidamente per filtrazione e lisate mediante macinazione criogenica. Il lisato è stato poi diviso in due: uno per le impronte totali di mRNA protette dai ribosomi e l'altro per impronte di mRNA protette da ribosomi selezionate, su cui abbiamo eseguito la purificazione dell'affinità per abbattere i complessi di catene proteiche-ribosomi-nascenti marca.......

Discussione

Qui, il protocollo descrive in dettaglio l'approccio Selective Ribosome Profiling per l'acquisizione di interazioni co-traslazionali in risoluzione quasi codone. Mentre il ribosoma sale come hub per coordinare l'emergenza della catena nascente nel citoplasma affollato, questo è un metodo cruciale per identificare e caratterizzare le varie interazioni co-traduzionali necessarie per garantire un proteoma funzionale, nonché per studiare varie malattie. Ad oggi, la SeRP è l'unico metodo in grado di catturare e caratterizzare.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3'-Fosforilato 28 nt RNA di controllo oligonucleotide	IDT	ordine personalizzato	RNasi libera HPLC purificazione; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'Etanolo
assoluto	VWR	20821
Fenolo acido– cloroformio	Ambion	AM9722
Anticorpo: topo monclonale anti-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinina	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto agar	BD	214030
Bacto peptone	BD	211820
Bacto triptone	BD
Estratto di lievito Bacto	BD	212720
Bestatin cloridrato	Roth	2937.2
Cloroformio	Merck	102445
CircLigasi II ssDNA ligasi*	Epicentro	CL9025K	100 U/μ L
Soluzione colorante colloidale Coomassie	Roth	4829
compresse da cocktail complete di inibitori della proteasi senza EDTA	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
Acqua filtrata sterile e trattata con DEPC*	Sigma	95284
D-Glucosio anidro	Merck	G5767-500G
Dietilpirocarbonato	Roth	K028
Dimetilsolfossido*	Sigma-Aldrich	276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA caricamento colorante*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNasi I, set di	Roche	4716728001	RNAsi libero
*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glicerolo	VWR	24388.260.
Soluzione di glicina	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion polimerasi*	NEB	M0530L
HK da S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Acido cloridrico	AppliChem	A1305
Isopropanolo	Sigma-Aldrich	33539
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside	Roth	CN08
Kanamicina	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L (rt)	IDT	ordine
Azoto
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4· 2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4· H2O	Roth	K300.2
Sepharose attivato da NHS 4 perle a flusso rapido	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 sostituto	Sigma	74385
Pepstatina A Roth		2936.2
Fenilmetilsulfonilfluoruro	Roth	6367
Gel prefabbricati	Bio-Rad	5671034	10% e 12%
RNasi I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNasi libera
Acetato di sodio*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5,5
Sodio azide	Merck	S8032-100G
Cloruro di sodio		Roth 9265
Idrossido di sodio*	Sigma	S2770	1 N
Saccarosio	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNasi Inibitore	Ambion	AM2694
Superscript III Trascendenza inversa*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 polinucleotide chinasi*	NEB	M0201L
T4 RNA ligasi 2*	NEB	M0242L
Gel di poliacrilammide TBE*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE– gel di poliacrilammide urea*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE– gel di poliacrilammide urea*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE– tampone per campioni di urea*	Novex	LC6876	2×
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8.0
UltraPure 10&volte; Tampone TBE*	Invitrogen	15581-044
* - per la preparazione
guarnizione e morsetto a molla, 90 mm,Millipore
Pallone XX1009020 1 L ,	Millipore	XX1504705

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