Articolo metodologico

Analisi dello stress ossidativo negli organoidi intestinali murini utilizzando la sonda fluorogenica sensibile alle specie reattive dell'ossigeno

DOI:

10.3791/62880

⸱

17 settembre 2021

 ,  ,  , 
1Molecular Microbial Pathogenesis Unit, Institut Pasteur, 2Chaire de Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Institut de Biologie Paris Seine (IBPS) - Developmental Biology Unit, Sorbonne Université, CNRS UMR7622, INSERM U1156, 4Molecular Radiotherapy, INSERM U1030, Gustave Roussy, Université Paris-Saclay, 5The Center for Microbes, Development and Health, Institut Pasteur Shanghai and Chinese Academy of Sciences, 6Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) negli organoidi murini intestinali utilizzando l'imaging qualitativo e i saggi quantitativi di citometria. Questo lavoro può essere potenzialmente esteso ad altre sonde fluorescenti per testare l'effetto di composti selezionati sui ROS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) svolgono un ruolo essenziale nell'omeostasi intestinale. I ROS sono sottoprodotti naturali del metabolismo cellulare. Sono prodotti in risposta a infezioni o lesioni a livello mucoso in quanto sono coinvolti nelle risposte antimicrobiche e nella guarigione delle ferite. Sono anche messaggeri secondari critici, che regolano diversi percorsi, tra cui la crescita e la differenziazione cellulare. D'altra parte, livelli eccessivi di ROS portano a stress ossidativo, che può essere deleterio per le cellule e favorire malattie intestinali come l'infiammazione cronica o il cancro. Questo lavoro fornisce un metodo semplice per rilevare i ROS negli organoidi murini intestinali mediante imaging dal vivo e citometria a flusso, utilizzando una sonda fluorogenica disponibile in commercio. Qui il protocollo descrive l'analisi dell'effetto di composti che modulano l'equilibrio redox negli organoidi intestinali e rilevano i livelli di ROS in specifici tipi di cellule intestinali, esemplificato qui dall'analisi delle cellule staminali intestinali geneticamente etichettate con GFP. Questo protocollo può essere utilizzato con altre sonde fluorescenti.

Introduzione

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Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono sottoprodotti naturali del metabolismo cellulare. Possono anche essere prodotti attivamente da complessi enzimatici specializzati come le NADPH-ossidasi legate alla membrana (NOX) e le dual ossidasi (DUOX), che generano anione superossido e perossido di idrogeno1. Esprimendo enzimi antiossidanti e spazzini ROS, le cellule possono sintonizzare finemente il loro equilibrio redox, proteggendo così l'omeostasi dei tessuti2. Sebbene i ROS possano essere altamente tossici per le cellule e danneggiare il DNA, le proteine e i lipidi, sono molecole di segnalazione cruciali2. Nell'epitelio intestinale sono necessari livelli moderati di ROS per la proliferazione delle cellule staminali e progenitrici3; alti livelli di ROS portano alla loro apoptosi4. Lo stress ossidativo cronico è legato a molte malattie gastrointestinali, come le malattie infiammatorie intestinali o il cancro. Ad esempio, in un modello murino di cancro intestinale guidato da Wnt, è risultata necessaria un'elevata produzione di ROS attraverso l'attivazione di NADPH-ossidasi per l'iperproliferazione delle cellule tumorali5,6. Definire come le cellule intestinali, in particolare le cellule staminali, gestiscono lo stress ossidativo e come l'ambiente cellulare può influire su questa capacità è essenziale per comprendere meglio l'eziologia di questa malattia7.

In un tessuto, diversi tipi di cellule presentano uno stato ossidativo basale che può variare in base alla loro funzione e al loro metabolismo e all'espressione di diversi livelli di molecole ossidanti e antiossidanti4,7. Il monitoraggio dei ROS in vivo è molto impegnativo. I coloranti permeabili alle cellule che emettono fluorescenza in base al loro stato redox sono stati sviluppati per visualizzare e misurare i ROS cellulari nelle cellule viventi e negli animali. Tuttavia, la loro efficacia dipende dalla loro diffusione all'interno dei tessuti viventi e dalla loro rapida lettura, rendendoli difficili da usare nei modelli animali8.

In passato, lo studio dell'effetto dei composti sulla generazione di ROS è stato fatto utilizzando linee cellulari, ma questo potrebbe non riflettere la situazione in vivo . Il modello organoide intestinale, sviluppato dal gruppo di Clevers9, consente la crescita di cellule primarie intestinali ex vivo. La coltura di cripte intestinali in matrici, in presenza di fattori di crescita definiti, porta a strutture tridimensionali, chiamate organoidi (mini-intestino), che riproducono l'organizzazione cripto-villi, con cellule delle diverse linee epiteliali che rivestono un lume interno e le cellule staminali intestinali che risiedono in piccole sporgenze simili a cripte.

Qui, sfruttando questo modello, viene descritto un metodo semplice per studiare lo stress ossidativo nelle cellule intestinali primarie alla risoluzione di una singola cellula aggiungendo un colorante ros-sensibile disponibile in commercio nel terreno di coltura organoide.

I lettori di lastre sono spesso utilizzati per rilevare la produzione di ROS in una popolazione totale. Questo protocollo utilizza la citometria a flusso o il test di imaging per rilevare ROS in un particolare tipo di cellula con cellule geneticamente modificate o colorazione anticorpale specifica. Questo lavoro coinvolge la coltura di organoidi intestinali di topo e la visualizzazione ROS mediante imaging confocale e quantificazione mediante citometria a flusso. Utilizzando gli organoidi dell'intestino tenue derivati da topi Lgr5-GFP, è possibile analizzare in modo specifico il livello di stress ossidativo nelle cellule staminali intestinali con diversi trattamenti. Questo protocollo può essere adattato per testare l'influenza di molecole esogene, come il muramil-dipeptide derivato dal microbiota (MDP)10, sul bilancio ROS, dopo aver stimolato gli organoidi con i composti selezionati.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati dopo l'approvazione da parte del Comitato per l'uso dell'Institut Pasteur e del Ministero dell'Agricoltura francese n. 2016-0022. Tutti i passaggi vengono eseguiti all'interno di una cappa di coltura tissutale.

1. Preparazione di reagenti e materiali per la coltivazione di organoidi intestinali

  1. Per preparare il terreno di coltura, mescolare DMEM/F-12 avanzato integrato con 1x glutammina, 1x soluzione di penicillina/streptomicina (P/S), 10 mM di HEPES, 50 ng/mL di EGF murino, 20 μg/mL di Noggin murino 500 ng/mL di R-Spondin1 di topo (vedi Tabella dei materiali). Lasciare il mezzo a temperatura ambiente (RT) durante l'estrazione della cripta.
    NOTA: Congelare il mezzo inutilizzato in aliquote a -20 °C. Evitare il congelamento e il disgelo.
  2. Riempire un tubo da 50 mL con 40 mL di Advanced DMEM/F-12 e tenerlo sul ghiaccio.
    NOTA: Mantenere il mezzo inutilizzato a 4 °C. Sarà utilizzato per il passaggio degli organoidi.
  3. Preriscaldare le piastre di coltura cellulare (camere di pozzo μ-Slide 8 e/o fondo rotondo a 96 pozzetti) nell'incubatore a 37 °C.
  4. Matrice di membrana basale di disgelo (BMM) (vedi Tabella dei materiali) aliquote sul ghiaccio (prima di iniziare il protocollo o almeno 1 ora prima della placcatura delle cripte).
    NOTA: il BMM si solidificherà rapidamente se non mantenuto freddo.
  5. Preparare la soluzione di lavaggio/lavaggio aggiungendo la soluzione di penicillina-streptomicina all'1% di DPBS (DPBS-P/S).
  6. Riempire una capsula di Petri da 100 mm con 10 mL di DPBS-P/S freddo. Riempire sei tubi da 15 mL con 10 mL di DPBS ed etichettarli da F1 a F6.
  7. Preparare 30 mL di soluzione edTA da 10 mM mediante diluizione da 0,5 M EDTA in DPBS. Riempire due tubi da 15 ml con 10 mL di EDTA da 10 mM ed etichettarli E1 ed E2.
  8. Tenere tutte le soluzioni pre-raffreddate a 4°C e tenerle sul ghiaccio durante la procedura.

2. Coltura di organoidi intestinali

  1. Sacrificare un mouse Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) di 8-10 settimane secondo le norme e i regolamenti nazionali.
  2. Raccogliere 5-8 cm del digiuno che comprende la regione tra il duodeno (5 cm dallo stomaco) e l'ileo (10 cm dal cieco) e tenere a freddo DPBS-P/S sul ghiaccio.
  3. Pulire il contenuto intestinale lavando con 5-10 ml di DPBS-P/S freddo.
    NOTA: le siringhe da incasso fatte in casa possono essere ottenute collegando una punta da 200 μL a un ugello per siringa da 10 mL.
  4. Aprire l'intestino longitudinalmente usando le forbici a punta di sfera (vedi Tabella dei materiali) (per evitare di danneggiare il tessuto).
  5. Utilizzando una pinza, trasferire il tessuto in una capsula di Petri contenente DPBS-P/S freddo a temperatura ambiente e agitarlo per risciacquare.
  6. Con una pipetta Pasteur di plastica, afferrare l'intestino per aspirazione e trasferirlo in un tubo da 15 ml etichettato E1 contenente 10 mL di freddo 10 mM EDTA.
  7. Capovolgere il tubo 3 volte e incubare sul ghiaccio per 10 minuti.
  8. Utilizzando una pipetta Pasteur in plastica, trasferire il tessuto nel tubo F1 contenente 10 mL DPBS. Vortice per 2 minuti (sul vortice normale, tenendo il tubo a mano e assicurandosi che l'intestino turbini bene).
  9. Metti 10 μL della frazione in una capsula di Petri e valuta la qualità della frazione al microscopio.
    NOTA: Tutti i passi del vortice vengono eseguiti alla massima velocità e la qualità di ciascuna frazione deve essere valutata al microscopio (Figura 1).
  10. Con una pipetta Pasteur di plastica, afferrare l'intestino per aspirazione e trasferirlo nel tubo F2 contenente 10 ml di DPBS e vortice per 2 minuti.
  11. Ripetere il passaggio 2.10, trasferendo il tessuto nel tubo F3 contenente 10 ml di DPBS e vortice per 2 minuti.
  12. Ripetere l'incubazione edta come nel passaggio 2.6, trasferendo il tessuto nel tubo E2 contenente 10 mM EDTA.
  13. Capovolgere il tubo 3 volte e incubare sul ghiaccio per 5 minuti.
  14. Ripetere il passaggio 2.10, trasferendo il tessuto nel tubo F4 contenente 10 mL dpBS e vortice per 3 min.
  15. Ripetere il passaggio 2.14, trasferendo il tessuto nel tubo F5 contenente 10 ml di DPBS e vortice per 3 minuti.
  16. Ripetere il passaggio 2.15, trasferendo il tessuto nel tubo F6 contenente 10 mL dpBS e vortice per 3 min.
  17. Combina le migliori frazioni filtranti per gravità attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un tubo da 50 ml (su ghiaccio) per eliminare villi e detriti significativi.
    NOTA: Di solito, F5 e F6 sono le frazioni contenenti numerose cripte e meno detriti.
  18. Ruotare le cripte a 150 x g a 4 °C per 3 min.
  19. Svuotare il tubo, interrompere meccanicamente il pellet e aggiungere 5 ml di DMEM/F12 freddo.
  20. Mettere 10 μL della sospensione in una capsula di Petri e contare manualmente al microscopio il numero di cripte presenti nell'aliquota.
    NOTA: non contare celle singole o piccoli detriti.
  21. Calcola il volume (V) di sospensione delle cripte richiesto in μL, considerando che 300 cripte sono placcate per pozzetto, W è il numero di pozzi e N è il numero di cripte contate su 10 μL della sospensione. Trasferire le cripte in un nuovo tubo da 15 ml.
    NOTA: V = 300 x L x 10/N. Se nell'esperimento pianificato viene utilizzato un piccolo volume, è possibile utilizzare un tubo centrifugo da 1,5 ml.
  22. Ruotare le cripte a 200 x g a 4 °C per 3 min.
  23. Rimuovere con attenzione il surnatante usando una pipetta.
  24. Interrompere meccanicamente il pellet e aggiungere delicatamente il terreno di coltura di crescita per ottenere una concentrazione di 90 cripte / μL.
  25. Aggiungere 2 volumi di BMM non diluito per avere una concentrazione finale di 30 cripte/μL. Pipettare con attenzione su e giù senza introdurre bolle d'aria nella miscela.
    NOTA: Tenere sempre il tubo sul ghiaccio per evitare la solidificazione BMM.
  26. Piastra 10 μL delle cripte / BMM mescolare in ogni pozzetto. Per l'analisi della citometria a flusso, utilizzare piastre a fondo tondo a 96 pozzetti. Distribuire 10 μL al centro di ciascun pozzetto come una cupola. Per l'imaging, utilizzare μ-slide 8 (vedere Tabella dei materiali) e depositare i 10 μL come strato sottile.
    NOTA: placcare gli organoidi come uno strato sottile per il test di imaging per consentire la loro imaging approfondito.
  27. Lasciare la piastra per 5 minuti a RT per consentire al BMM di solidificarsi. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 15 minuti.
  28. Aggiungere 250 μL di terreno di coltura in ogni pozzetto, facendo attenzione a non staccare il BMM.
  29. Posizionare le piastre nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
  30. Eseguire l'analisi ROS tra i giorni 4 e 6 della coltura. Altrimenti, cambiare il mezzo e dividere gli organoidi dopo la comparsa di diverse e lunghe strutture in erba e quando le cellule morte si accumulano nei lumen degli organoidi.

3. Organoidi che passano

  1. Inizia a passare piccoli organoidi intestinali dal 6 ° giorno di coltura, quando si sono formate strutture in erba significative e i lumi degli organoidi sono diventati scuri.
    NOTA: Il lume dell'organoide diventa scuro a causa dell'accumulo di cellule morte, detriti e muco. Evitare di lasciare che gli organoidi crescano troppo prima di dividersi. Il rapporto di scissione dipende dalla crescita degli organoidi. Si consiglia di passare gli organoidi con un rapporto di 1:2 al giorno 6 e 1:3 al giorno 10.
  2. Riempire un tubo da 15 mL con 4 mL di DMEM/F-12 avanzato freddo e tenerlo sul ghiaccio.
    NOTA: Qui vengono forniti i volumi per una piastra di coltura da 96 pozzetti. Se si utilizza un formato diverso, regolare il volume di conseguenza.
  3. Aspirare accuratamente il mezzo con una pipetta o una pompa per vuoto dai pozzetti senza toccare le cupole BMM e scartarlo.
  4. Aggiungere 100 μL di DMEM avanzato/F-12 freddo per pozzetto. Pipettare su e giù per rompere il BMM e trasferire il contenuto del pozzo nel tubo da 15 ml.
  5. Lavare il pozzetto con 200 μL di DMEM/F-12 avanzato a freddo e raccoglierlo nello stesso tubo.
    NOTA: se si passano più pozzi dalla stessa condizione sperimentale, il contenuto dei pozzetti può essere raggruppato nello stesso tubo di raccolta da 15 ml.
  6. Ruotare il tubo di raccolta da 15 mL a 100 x g per 5 minuti a 4°C.
  7. Scartare il surnatante e aggiungere 1 ml di DMEM/F-12 avanzato freddo al pellet. Utilizzando una punta P1000, prendere una punta P10 (senza filtro) e pipettare su e giù almeno 20 volte.
  8. Aggiungere 4 mL di DMEM/F-12 avanzato freddo al tubo. Girare a 300 x g per 5 minuti a 4°C.
  9. Aspirare il surnatante con una pipetta o una pompa per vuoto senza disturbare il pellet. Quindi, interrompere meccanicamente il pellet.
  10. Aggiungere BMM diluito nel terreno di coltura di crescita (rapporto 2:1). Pipettare con cura su e giù senza introdurre bolle d'aria nel mix.
  11. Piastra 10 μL delle cripte / BMM mescolare in ogni pozzetto.
  12. Tenere la piastra per 5 minuti a RT per consentire al BMM di solidificarsi. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 15 minuti.
  13. Aggiungere 250 μL di terreno di coltura in ciascun pozzetto.
    NOTA: Fare attenzione a non staccare il BMM.
  14. Posizionare le piastre nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.

4. Preparazione di reagenti e materiali per valutare lo stress ossidativo negli organoidi intestinali

  1. Preparare una soluzione madre da 250 mM di inibitore N-acetilcisteina (NAC) (vedere Tabella dei materiali), sospendere 10 mg con 245 μL di DPBS. Utilizzare a 1 mM di concentrazione finale.
  2. Preparare una soluzione madre da 50 mM di induttore Tert-butil idroperossido (tBHP), 70% in acqua, diluire 3,22 μL con 496,8 μL di DPBS. Utilizzare a 200 μM di concentrazione finale.
  3. Per lo studio di citometria a flusso, preparare una soluzione di lavoro da 250 μM di una sonda fluorogenica (vedere Tabella dei materiali) diluendo la soluzione madre 1/10 in DMSO. Utilizzare a 1 μM di concentrazione finale.
    NOTA: Come indicato nelle istruzioni del produttore, la sonda fluorogenica è sensibile alla luce e all'ossigeno. Le scorte e le aliquote non dovrebbero essere aperte e chiuse troppe volte.
  4. Per lo studio di imaging, preparare una soluzione di lavoro da 1,25 mM della sonda fluorogenica diluendo la soluzione madre 1/2 in DMSO. Utilizzare a 5 μM di concentrazione finale.
  5. Preparare una soluzione finale di 0,1 μg/mL DAPI in DPBS, da utilizzare per la discriminazione delle cellule morte nel saggio di citometria a flusso.
  6. Diluire Hoechst 33342 a 1,25 mg/mL in DPBS. Utilizzare a 5 μg/mL di concentrazione finale da utilizzare per la colorazione nucleare nel test di imaging.
  7. DMEM caldo senza rosso fenolo a 37 °C.
    NOTA: questi passaggi descrivono l'utilizzo di controlli negativi e positivi che devono essere inclusi in qualsiasi test, utilizzando le condizioni indicate nella Figura 2A. Il test può essere utilizzato per testare composti antiossidanti o pro-ossidanti. I passaggi sono gli stessi e l'unica differenza è quando i composti vengono aggiunti prima di utilizzare il colorante fluorogenico.

5. Visualizzazione dello stress ossidativo in organoidi 3D mediante microscopia confocale

  1. Prelevare gli organoidi placcati nelle camere del pozzo μ-Slide 8 e aggiungere 1 μL di soluzione madre NAC nei pozzetti corrispondenti per ottenere una concentrazione finale di 1 mM.
  2. Incubare per 1 ora a 37 °C e 5% di CO2.
  3. Aggiungere 1 μL di soluzione madre tBHP nei pozzetti corrispondenti per ottenere una concentrazione finale di 200 μM.
  4. Incubare per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
  5. Aggiungere 1 μL per pozzetto della diluizione di 1,25 mM della sonda fluorogenica per ottenere una concentrazione finale di 5 μM.
  6. Aggiungere 1 μL per pozzetto della diluizione di Hoescht da 1,25 mg/mL per ottenere una concentrazione finale di 5 μg/mL.
  7. Incubare per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
  8. Rimuovere il supporto senza disturbare il BMM. Aggiungere delicatamente 250μL di DMEM caldo senza rosso fenolo.
    NOTA: se è prevista un'acquisizione a lungo termine, aggiungere composti dei fattori di crescita al DMEM senza rosso fenolo.
  9. Immagina gli organoidi usando un microscopio confocale dotato di una camera termica e di un'alimentazione di gas che rileva la sonda fluorogenica (ROS).
    NOTA: L'eccitazione/emissione (ex/em) per la sonda fluorogenica è 644/665, ex/em per Hoechst (nuclei) è 361/486 ed ex/em per GFP (cellula staminale intestinale dei topi Lgr5-GFP) è 488/510. Un obiettivo di immersione in olio 63x viene utilizzato per rilevare i segnali nelle cellule staminali. Non modificare le impostazioni laser tra i campioni. Un obiettivo 20x potrebbe essere utilizzato per consentire una panoramica della produzione ROS.
  10. Utilizzare il controllo positivo per impostare l'intensità del laser e l'esposizione temporale per il segnale ROS e verificare che questo segnale sia inferiore nel controllo negativo.
  11. Utilizzando lo schermo oculare la diapositiva per identificare gli organoidi GFP che esprimono e regolare l'intensità del laser.
    NOTA: questo passaggio viene eseguito manualmente.
  12. Definire le posizioni per ottenere un'immagine cucita dell'intero organoide. Impostare uno z-stack di 25 μm (dimensione del gradino 5 μm) per ottenere una sezione degli organoidi che mostra uno strato di cellule.
    NOTA: fare riferimento al manuale utente del microscopio per ottimizzare la configurazione. Utilizzando cellule viventi, l'acquisizione dovrebbe essere effettuata entro 1 ora dalla fine dell'incubazione.
  13. Aprire le immagini in un software di elaborazione delle immagini open source (vedere Tabella dei materiali).
  14. Passa attraverso lo z-stack e scegli la sezione in cui il centro degli organoidi è ben rappresentato e crea una nuova immagine con l'area selezionata.
  15. Quantificare le immagini secondo i passaggi 5.15.1 - 5.15.5.
    1. Selezionare lo strumento linea a mano libera.
    2. Disegna una linea seguendo i nuclei.
      NOTA: selezionare solo le regioni che presentano cellule GFP-positive se vengono analizzate solo le cellule staminali.
    3. Aumentare la larghezza della linea per coprire lo strato cellulare con la linea senza includere i detriti luminali.
    4. Selezionare il canale per il segnale ROS e misurare l'intensità di fluorescenza nella regione selezionata e annotare i valori.
    5. Disegna una linea dove non c'è segnale e misura l'intensità fluorescente dello sfondo che verrà sottratta al valore precedente per ottenere l'intensità finale.

6. Quantificazione dello stress ossidativo sugli organoidi dissociati mediante citometro a flusso

  1. Aggiungere 1 μL di soluzione madre NAC nei pozzetti per i controlli negativi per ottenere una concentrazione finale di 1 mM.
    NOTA: Utilizzare gli organoidi placcati nelle piastre a fondo tondo a 96 pozzetti.
  2. Incubare per 1 ora a 37 °C e 5% di CO2.
  3. Aggiungere 1 μL di soluzione madre tBHP nei pozzetti corrispondenti per ottenere una concentrazione finale di 200 μM.
  4. Incubare per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
  5. Con una pipetta multicanale, rimuovere il mezzo senza disturbare il BMM collegato e trasferirlo su un'altra piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti. Tieni da parte questo piatto.
  6. Aggiungere 100 μL di tripsina e, con una pipetta multicanale, pipettare su e giù almeno cinque volte per distruggere il BMM.
  7. Incubare per non più di 5 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
  8. Con una pipetta multicanale, pipetta su e giù almeno cinque volte per dissociare gli organoidi.
  9. Girare a 300 x g per 5 minuti a RT.
  10. Scartare il surnatante invertendo la piastra. Aggiungere nuovamente il mezzo raccolto nel passaggio 6.3 ai pozzetti corrispondenti e risospesciare le celle tubando su e giù 5 volte.
  11. Aggiungere la sonda fluorogenica alla concentrazione finale di 1 μM. Aggiungere 1 μL per pozzetto dalla diluizione di 250 μM e incubare per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
    NOTA: Non aggiungere la sonda fluorogenica ai pozzetti necessari per le impostazioni dello strumento (Figura 2B).
  12. Girare a 300 x g per 5 minuti a RT.
  13. Risospendare le celle con 250 μL di soluzione DAPI da 0,1 μg/mL. Trasferire i campioni nelle apposite provette citometriche a flusso, tenere le provette sul ghiaccio e procedere con l'analisi.
    NOTA: Aggiungere PBS anziché DAPI ai pozzetti necessari per le impostazioni dello strumento (Figura 2B).
  14. Ottimizza le impostazioni della tensione di dispersione anteriore e laterale sul controllo non macchiato e sulle tensioni laser per ciascun fluoroforo utilizzando campioni monomacchiati.
  15. Utilizzando una strategia di gating appropriata (Figura 4A), raccogliere un minimo di 20.000 eventi.
    NOTA: sono preferiti 50.000 eventi. Le impostazioni di acquisizione dettagliate variano a seconda dello strumento utilizzato.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Come prova di concetto del protocollo descritto, sono state utilizzate le cripte ottenute dalla linea di topi Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 in cui le cellule staminali intestinali mostrano un'espressione GFP a mosaico, che è stata stabilita da Barker et al., per caratterizzare inizialmente le cellule staminali intestinali10 e consentire di mappare queste cellule in base alla loro espressione GFP. Viene quindi fornito un modello per confrontare i livelli di ROS in una specifica popolazione di tipo cellula...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro fornisce un protocollo passo-passo per isolare le cripte digiunali murine, coltivarle in organoidi 3D e analizzare i ROS negli organoidi combinando una sonda fluorogenica sensibile ai ROS con l'imaging al microscopio qualitativo di organidi interi e la misurazione quantitativa dei ROS utilizzando la citometria a flusso su singole cellule dopo la dissociazione organoide.

Il primo passo critico in questo metodo è la procedura di estrazione delle cripte. In effetti, la qualità della...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 17-CE14-0022 (i-Stress) dell'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)The Jackson Laboratory
Terreno di coltura di crescita
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)ThermoFisher12634010
B-27 Supplement, meno vitamina AThermoFisher12587010Concentrazione di riserva: 50x
GlutaMAX (glutammina)ThermoFisher35050038Concentrazione di riserva: 100x
HepesThermoFisher15630056Concentrazione di riserva: 1 M
di EGF murinoR& D2028-EG-200Concentrazione di riserva: 500 µ g/mL in PBS
Noggin R& D1967-NG/CFConcentrazione di base: 100 & micro; g/mL in PBS
R-spondina murina1R& D3474-RS-050Concentrazione di riserva: 50 &; micro; g/mL nell'integratore PBS
N-2ThermoFisher17502048Stock Concentrazione: 100x
Penicillina-Streptomicina (P/S)ThermoFisher15140122Concentrazione stock: 100x (10.000 unità/mL di penicillina e 10.000 µ g/mL di streptomicina)
Materiale
70 &; filtro cellulare mCorning352350
rotondo a 96 pozzettiForbice con3799
Fine Science Tools GMBH14086-09
CellROX® Reagente rosso intensoThermoFisherC10422
DAPI (4',6-diamidino-2-phé nylindole, dicloroidrato) (fluorgenic probe)ThermoFisherD1306stock a 10 mg/mL
DPBS 1x no calcio no magnesio (DPBS)ThermoFisher14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)ThermoFisherA1896701
Hoechst 33342ThermoFisherH3570stock a 10 mg/mL
Matrigel Fattore di crescita ridotto, privo di rosso fenolo (Basement Membrane Matrix)Corning356231una volta ricevuto scongelare o/n in frigorifero, conservare per 1 ora sul ghiaccio e, fare 500 ml di aliquote e conservare a -20 ° C
µ-Slide 8 Camere a pozzettiIbidi80826
Soluzione di N-acetilcisteina (NAC)SigmaA9165
terz-butile idroperossido (tBCHP) (70% in peso. In H2O2)Sigma458139
TrypLE Express Enzyme (1X), senza rosso fenolo (tripsina)ThermoFisher12604013
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0ThermoFisher15575020
Y-27632SigmaY0503Rock-inhibitor da utilizzare per ridurre al minimo la morte cellulare in caso di dissociazione tissutale
Programmi ed apparecchiature
Attune NxT (citometro a flusso)ThermoFischerCitometro a flusso
analizzatore Fiji/ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsgenerazione di immagini
FlowJoBD BioscienceFACS analysis
Observer.Z1Zeisssistema confocale
campo spazzato)Sistema confocaleBruker
alta velocità EMCCD Camera Evolve Delta 512Sistema confocalefotometrico
PrismGraphPad Softwareanalisi statistica
fondo punta sferica Corning Opterra (confocale a ad

Riferimenti

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