Il presente protocollo descrive un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) negli organoidi murini intestinali utilizzando l'imaging qualitativo e i saggi quantitativi di citometria. Questo lavoro può essere potenzialmente esteso ad altre sonde fluorescenti per testare l'effetto di composti selezionati sui ROS.
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Articolo metodologico
Analisi dello stress ossidativo negli organoidi intestinali murini utilizzando la sonda fluorogenica sensibile alle specie reattive dell'ossigeno
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) svolgono un ruolo essenziale nell'omeostasi intestinale. I ROS sono sottoprodotti naturali del metabolismo cellulare. Sono prodotti in risposta a infezioni o lesioni a livello mucoso in quanto sono coinvolti nelle risposte antimicrobiche e nella guarigione delle ferite. Sono anche messaggeri secondari critici, che regolano diversi percorsi, tra cui la crescita e la differenziazione cellulare. D'altra parte, livelli eccessivi di ROS portano a stress ossidativo, che può essere deleterio per le cellule e favorire malattie intestinali come l'infiammazione cronica o il cancro. Questo lavoro fornisce un metodo semplice per rilevare i ROS negli organoidi murini intestinali mediante imaging dal vivo e citometria a flusso, utilizzando una sonda fluorogenica disponibile in commercio. Qui il protocollo descrive l'analisi dell'effetto di composti che modulano l'equilibrio redox negli organoidi intestinali e rilevano i livelli di ROS in specifici tipi di cellule intestinali, esemplificato qui dall'analisi delle cellule staminali intestinali geneticamente etichettate con GFP. Questo protocollo può essere utilizzato con altre sonde fluorescenti.
Introduzione
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono sottoprodotti naturali del metabolismo cellulare. Possono anche essere prodotti attivamente da complessi enzimatici specializzati come le NADPH-ossidasi legate alla membrana (NOX) e le dual ossidasi (DUOX), che generano anione superossido e perossido di idrogeno1. Esprimendo enzimi antiossidanti e spazzini ROS, le cellule possono sintonizzare finemente il loro equilibrio redox, proteggendo così l'omeostasi dei tessuti2. Sebbene i ROS possano essere altamente tossici per le cellule e danneggiare il DNA, le proteine e i lipidi, sono molecole di segnalazione cruc....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati dopo l'approvazione da parte del Comitato per l'uso dell'Institut Pasteur e del Ministero dell'Agricoltura francese n. 2016-0022. Tutti i passaggi vengono eseguiti all'interno di una cappa di coltura tissutale.
1. Preparazione di reagenti e materiali per la coltivazione di organoidi intestinali
- Per preparare il terreno di coltura, mescolare DMEM/F-12 avanzato integrato con 1x glutammina, 1x soluzione di penicillina/streptomicina (P/S), 10 mM di HEPES, 50 ng/mL di EGF murino, 20 μg/mL di Noggin murino 500 ng/mL di R-Spondin1 di topo (vedi Tabella dei materiali
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Risultati
Come prova di concetto del protocollo descritto, sono state utilizzate le cripte ottenute dalla linea di topi Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 in cui le cellule staminali intestinali mostrano un'espressione GFP a mosaico, che è stata stabilita da Barker et al., per caratterizzare inizialmente le cellule staminali intestinali10 e consentire di mappare queste cellule in base alla loro espressione GFP. Viene quindi fornito un modello per confrontare i livelli di ROS in una specifica popolazione di tipo cellula.......
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Discussione
Questo lavoro fornisce un protocollo passo-passo per isolare le cripte digiunali murine, coltivarle in organoidi 3D e analizzare i ROS negli organoidi combinando una sonda fluorogenica sensibile ai ROS con l'imaging al microscopio qualitativo di organidi interi e la misurazione quantitativa dei ROS utilizzando la citometria a flusso su singole cellule dopo la dissociazione organoide.
Il primo passo critico in questo metodo è la procedura di estrazione delle cripte. In effetti, la qualità della.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 17-CE14-0022 (i-Stress) dell'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Terreno di coltura di crescita | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, meno vitamina A | ThermoFisher | 12587010 | Concentrazione di riserva: 50x |
| GlutaMAX (glutammina)ThermoFisher | 35050038 | Concentrazione di riserva: 100x | |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Concentrazione di riserva: 1 M |
| di EGF murino | R& D | 2028-EG-200 | Concentrazione di riserva: 500 µ g/mL in PBS |
| Noggin R | & D | 1967-NG/CF | Concentrazione di base: 100 & micro; g/mL in PBS |
| R-spondina murina1 | R& D | 3474-RS-050 | Concentrazione di riserva: 50 &; micro; g/mL nell'integratore PBS |
| N-2 | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentrazione: 100x |
| Penicillina-Streptomicina (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Concentrazione stock: 100x (10.000 unità/mL di penicillina e 10.000 µ g/mL di streptomicina) |
| Materiale | |||
| 70 &; filtro cellulare m | Corning | 352350 | |
| rotondo a 96 pozzetti | Forbice con | 3799 | |
| Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | ||
| CellROX® Reagente rosso intenso | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phé nylindole, dicloroidrato) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock a 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcio no magnesio (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)ThermoFisher | A1896701 | ||
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock a 10 mg/mL |
| Matrigel Fattore di crescita ridotto, privo di rosso fenolo (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | una volta ricevuto scongelare o/n in frigorifero, conservare per 1 ora sul ghiaccio e, fare 500 ml di aliquote e conservare a -20 ° C |
| µ-Slide 8 Camere a pozzetti | Ibidi | 80826 | |
| Soluzione di N-acetilcisteina (NAC) | Sigma | A9165 | |
| terz-butile idroperossido (tBCHP) (70% in peso. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), senza rosso fenolo (tripsina)ThermoFisher | 12604013 | ||
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor da utilizzare per ridurre al minimo la morte cellulare in caso di dissociazione tissutale |
| Programmi ed apparecchiature | |||
| Attune NxT (citometro a flusso) | ThermoFischer | Citometro a flusso | |
| analizzatore Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | generazione di immagini | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | sistema confocale | |
| campo spazzato) | Sistema confocale | Bruker | |
| alta velocità EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Sistema confocale | fotometrico | |
| Prism | GraphPad Software | analisi statistica |
Riferimenti
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequence....
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Ristampe e permessi
