Articolo metodologico

Analisi dello stress ossidativo negli organoidi intestinali murini utilizzando la sonda fluorogenica sensibile alle specie reattive dell'ossigeno

DOI:

10.3791/62880

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17 settembre 2021

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1Molecular Microbial Pathogenesis Unit, Institut Pasteur, 2Chaire de Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Institut de Biologie Paris Seine (IBPS) - Developmental Biology Unit, Sorbonne Université, CNRS UMR7622, INSERM U1156, 4Molecular Radiotherapy, INSERM U1030, Gustave Roussy, Université Paris-Saclay, 5The Center for Microbes, Development and Health, Institut Pasteur Shanghai and Chinese Academy of Sciences, 6Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur

In questo articolo

Sommario

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Il presente protocollo descrive un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) negli organoidi murini intestinali utilizzando l'imaging qualitativo e i saggi quantitativi di citometria. Questo lavoro può essere potenzialmente esteso ad altre sonde fluorescenti per testare l'effetto di composti selezionati sui ROS.

Abstract

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Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) svolgono un ruolo essenziale nell'omeostasi intestinale. I ROS sono sottoprodotti naturali del metabolismo cellulare. Sono prodotti in risposta a infezioni o lesioni a livello mucoso in quanto sono coinvolti nelle risposte antimicrobiche e nella guarigione delle ferite. Sono anche messaggeri secondari critici, che regolano diversi percorsi, tra cui la crescita e la differenziazione cellulare. D'altra parte, livelli eccessivi di ROS portano a stress ossidativo, che può essere deleterio per le cellule e favorire malattie intestinali come l'infiammazione cronica o il cancro. Questo lavoro fornisce un metodo semplice per rilevare i ROS negli organoidi murini intestinali mediante imaging dal vivo e citometria a flusso, utilizzando una sonda fluorogenica disponibile in commercio. Qui il protocollo descrive l'analisi dell'effetto di composti che modulano l'equilibrio redox negli organoidi intestinali e rilevano i livelli di ROS in specifici tipi di cellule intestinali, esemplificato qui dall'analisi delle cellule staminali intestinali geneticamente etichettate con GFP. Questo protocollo può essere utilizzato con altre sonde fluorescenti.

Introduzione

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Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono sottoprodotti naturali del metabolismo cellulare. Possono anche essere prodotti attivamente da complessi enzimatici specializzati come le NADPH-ossidasi legate alla membrana (NOX) e le dual ossidasi (DUOX), che generano anione superossido e perossido di idrogeno1. Esprimendo enzimi antiossidanti e spazzini ROS, le cellule possono sintonizzare finemente il loro equilibrio redox, proteggendo così l'omeostasi dei tessuti2. Sebbene i ROS possano essere altamente tossici per le cellule e danneggiare il DNA, le proteine e i lipidi, sono molecole di segnalazione cruc....

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati dopo l'approvazione da parte del Comitato per l'uso dell'Institut Pasteur e del Ministero dell'Agricoltura francese n. 2016-0022. Tutti i passaggi vengono eseguiti all'interno di una cappa di coltura tissutale.

1. Preparazione di reagenti e materiali per la coltivazione di organoidi intestinali

  1. Per preparare il terreno di coltura, mescolare DMEM/F-12 avanzato integrato con 1x glutammina, 1x soluzione di penicillina/streptomicina (P/S), 10 mM di HEPES, 50 ng/mL di EGF murino, 20 μg/mL di Noggin murino 500 ng/mL di R-Spondin1 di topo (vedi Tabella dei materiali

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Risultati

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Come prova di concetto del protocollo descritto, sono state utilizzate le cripte ottenute dalla linea di topi Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 in cui le cellule staminali intestinali mostrano un'espressione GFP a mosaico, che è stata stabilita da Barker et al., per caratterizzare inizialmente le cellule staminali intestinali10 e consentire di mappare queste cellule in base alla loro espressione GFP. Viene quindi fornito un modello per confrontare i livelli di ROS in una specifica popolazione di tipo cellula.......

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Discussione

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Questo lavoro fornisce un protocollo passo-passo per isolare le cripte digiunali murine, coltivarle in organoidi 3D e analizzare i ROS negli organoidi combinando una sonda fluorogenica sensibile ai ROS con l'imaging al microscopio qualitativo di organidi interi e la misurazione quantitativa dei ROS utilizzando la citometria a flusso su singole cellule dopo la dissociazione organoide.

Il primo passo critico in questo metodo è la procedura di estrazione delle cripte. In effetti, la qualità della.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 17-CE14-0022 (i-Stress) dell'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)The Jackson Laboratory
Terreno di coltura di crescita
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)ThermoFisher12634010
B-27 Supplement, meno vitamina AThermoFisher12587010Concentrazione di riserva: 50x
GlutaMAX (glutammina)ThermoFisher35050038Concentrazione di riserva: 100x
HepesThermoFisher15630056Concentrazione di riserva: 1 M
di EGF murinoR& D2028-EG-200Concentrazione di riserva: 500 µ g/mL in PBS
Noggin R& D1967-NG/CFConcentrazione di base: 100 & micro; g/mL in PBS
R-spondina murina1R& D3474-RS-050Concentrazione di riserva: 50 &; micro; g/mL nell'integratore PBS
N-2ThermoFisher17502048Stock Concentrazione: 100x
Penicillina-Streptomicina (P/S)ThermoFisher15140122Concentrazione stock: 100x (10.000 unità/mL di penicillina e 10.000 µ g/mL di streptomicina)
Materiale
70 &; filtro cellulare mCorning352350
rotondo a 96 pozzettiForbice con3799
Fine Science Tools GMBH14086-09
CellROX® Reagente rosso intensoThermoFisherC10422
DAPI (4',6-diamidino-2-phé nylindole, dicloroidrato) (fluorgenic probe)ThermoFisherD1306stock a 10 mg/mL
DPBS 1x no calcio no magnesio (DPBS)ThermoFisher14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)ThermoFisherA1896701
Hoechst 33342ThermoFisherH3570stock a 10 mg/mL
Matrigel Fattore di crescita ridotto, privo di rosso fenolo (Basement Membrane Matrix)Corning356231una volta ricevuto scongelare o/n in frigorifero, conservare per 1 ora sul ghiaccio e, fare 500 ml di aliquote e conservare a -20 ° C
µ-Slide 8 Camere a pozzettiIbidi80826
Soluzione di N-acetilcisteina (NAC)SigmaA9165
terz-butile idroperossido (tBCHP) (70% in peso. In H2O2)Sigma458139
TrypLE Express Enzyme (1X), senza rosso fenolo (tripsina)ThermoFisher12604013
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0ThermoFisher15575020
Y-27632SigmaY0503Rock-inhibitor da utilizzare per ridurre al minimo la morte cellulare in caso di dissociazione tissutale
Programmi ed apparecchiature
Attune NxT (citometro a flusso)ThermoFischerCitometro a flusso
analizzatore Fiji/ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsgenerazione di immagini
FlowJoBD BioscienceFACS analysis
Observer.Z1Zeisssistema confocale
campo spazzato)Sistema confocaleBruker
alta velocità EMCCD Camera Evolve Delta 512Sistema confocalefotometrico
PrismGraphPad Softwareanalisi statistica
fondo punta sferica Corning Opterra (confocale a ad

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
  2. Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequence....

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Organoidi murinicitometria a flussomicroscopia confocalecoltura di organoidianalisi delle cellule staminaliimaging live

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