Tessuto trattato con radioligandi attivati da fluorescenza per determinare l'origine cellulare del segnale radioattivo

Le malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer (AD), sono caratterizzate da una perdita neuronale associata ad un aumento dei sintomi. L'AD, la causa più comune di demenza, che rappresenta il 60%-70% dei casi, colpisce circa 50 milioni di persone in tutto il mondo¹. A livello neuropatologico, le due principali caratteristiche dell'AD sono l'accumulo di placche extracellulari amiloide-β (Aβ) e grovigli neurofibrillari intracellulari Tau. Alterazioni delle cellule gliali sono state anche associate all'AD² e alla possibile interruzione di diversi sistemi di neurotrasmettitori ^3,4.

La linea di ratto TgF344-AD è stata modificata nel modello AD esprimendo transgeni umani APP e PS1_ΔE9, portando all'espressione solubile e insolubile di Aβ-40 e Aβ-42 e alla formazione di placche amiloidi⁵. Presenta anche l'accumulo di forme iperfosforilate della proteina Tau che porta alla tauopatia. Dall'età di 9-24 mesi, i ratti sviluppano progressivamente i segni patologici dell'AD e un deterioramento cognitivo 5,6,7,8,9.

La tomografia ad emissione di positroni (PET), la tomografia computerizzata a emissione di fotoni singoli (SPECT) e l'autoradiografia sono tecniche basate sull'emissione e la quantificazione dei raggi γ. I radiotraccianti sono quantificati in vivo (PET e SPECT) o ex vivo/in vitro (autoradiografia). Queste tecniche sensibili hanno contribuito alla comprensione dei meccanismi di diverse malattie cerebrali, come l'AD. In effetti, in termini di neuroinfiammazione, ci sono molti studi che valutano 18 kDa Translocator Protein (TSPO), un marcatore di neuroinfiammazione in vivo, con traccianti radiomarcati come [¹¹C]-(R)-PK11195 o [¹¹C]PBR28 (per la revisione vedi¹⁰). Inoltre, le alterazioni dei sistemi di neurotrasmettitori sono state studiate utilizzando radiotraccianti 11,12,13.

Tuttavia, tali tecniche non determinano l'origine cellulare del segnale radioattivo. Ciò potrebbe ostacolare l'interpretazione delle basi biologiche dell'alterazione del legame di un radioligando in PET/SPECT. Ad esempio, nel caso degli studi TSPO sulla neuroinfiammazione, capire se l'aumento o la diminuzione del TSPO è dovuto a cambiamenti astrocitici o microgliali è di fondamentale importanza. La tecnica FACS-RTT (Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue) è stata sviluppata per aggirare questi problemi, consentendo la valutazione del legame radioligante in ogni tipo di cellula separatamente e la quantificazione della densità della proteina bersaglio per cellula. Questa tecnica innovativa è quindi complementare e altamente compatibile con l'imaging PET e SPECT.

Qui, questa tecnica è stata applicata lungo due assi: lo studio della neuroinfiammazione utilizzando radioligandi TSPO-specifici e la valutazione del sistema serotoninergico. Sul primo asse, l'obiettivo era quello di comprendere l'origine cellulare del segnale TSPO in risposta a una reazione infiammatoria acuta. Pertanto, FACS-RTT è stato utilizzato sui tessuti cerebrali dei ratti dopo l'induzione della neuroinfiammazione tramite iniezione di lipopolisaccaride (LPS) e a seguito di uno studio di imaging in vivo [¹²⁵I]CLINDE SPECT. Inoltre, lo stesso imaging e lo stesso protocollo FACS-RTT sono stati applicati su ratti TgF344-AD di 12 e 24 mesi e ratti wild-type (WT) corrispondenti. Il secondo asse mirava a determinare l'origine delle alterazioni del sistema serotoninergico in questo modello di ratto tramite la valutazione della densità ex vivo 5-HT_2AR per tipo di cellula.

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in accordo con il Comitato etico per la sperimentazione umana e animale del Cantone di Ginevra, la Commissione cantonale per l'etica della ricerca (CCER) e la Direzione generale della salute del Cantone di Ginevra (Svizzera), rispettivamente. I dati sono riportati seguendo le linee guida Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE).

1. Preparazione e calibrazione della telecamera SPECT

1. Accendere la fotocamera, caricare il software operativo (vedere Tabella dei materiali). Fare clic sul pulsante Home XYZ Stage per eseguire l'homing.
2. Imposta l'esperimento composto da un'acquisizione di scansione di 10 minuti. Impostare la modalità Step su Fine e la modalità Acquisition su Listmode (per registrare l'intero spettro di emissione).
3. Impostare il letto e assicurarsi che il sistema di riscaldamento, il sensore di respirazione e l'anestesia siano funzionali e sicuri (Figura 1A-D). Quindi, posizionare un fantasma (cioè 2 mL di una concentrazione nota di ¹²⁵I in un tubo di microfuga da 2 mL) dove verrà posizionata la testa dell'animale (centrata sull'area, Figura 1E).
4. Imposta l'area di scansione facendo scorrere i cursori per le tre dimensioni con l'aiuto delle tre immagini nella parte inferiore dello schermo. Assicurarsi che il volume di scansione del fantasma e dell'animale sia lo stesso.
5. Avviare la scansione fantasma per la successiva calibrazione con i parametri stabiliti nei passaggi 1.2-1.4.

2. Configurazione dell'area di lavoro per l'imaging SPECT

1. Pulire lo spazio di lavoro con virucida disinfettante e posizionare carte morbide su tutte le superfici.
2. Assicurarsi che ci sia abbastanza isoflurano e ossigeno nei rispettivi serbatoi.
3. Preparare un catetere da 24 G tagliando le pinne del catetere a farfalla per avere una visione più chiara della vena della coda del ratto.
4. Rivestire il catetere riempiendolo completamente con una soluzione di eparina (25000 U/mL) dopo aver rimosso l'ago. Quindi, riposizionare l'ago per evitare la formazione di coaguli di sangue dopo l'inserimento del catetere.

3. [¹²⁵I]CLINDE sintesi del radiotracciante

ATTENZIONE: La radioattività può avere energia ionizzante sufficiente per influenzare gli atomi delle cellule viventi e danneggiare il loro materiale genetico (DNA).

1. Assicurarsi di lavorare in un ambiente appropriato, autorizzato per esperimenti che coinvolgono la radioattività.
   NOTA: Indossare gli appositi dispositivi di protezione individuale (DPI), per la manipolazione della radioattività, compresi i dosimetri a dita e corpo. Cerca di rimanere a una distanza di sicurezza da qualsiasi fonte di radioattività.
2. Incubare 100 μg di precursore della tributilina in 100 μL di acido acetico con ioduro di sodio (Na¹²⁵I) (vedi Tabella dei materiali) e 5 μL di acido peracetico al 37% a 70 °C per 20 minuti in un termociclatore posizionato in un vano portaoggetti.
3. Diluire la reazione utilizzando il 50% di acetonitrile (ACN) in acqua per raggiungere un volume di 500 μL. Iniettare i 500 μL della reazione diluita su una colonna di fase inversa (vedere Tabella dei materiali).
4. Isolare il [¹²⁵I]CLINDE con una corsa HPLC a gradiente lineare dal 5% al 95% ACN in 7 mM H₃PO₄ per 10 min. Diluire l'isolato in H₂O per ottenere un volume finale di 10 ml, quindi iniettare la reazione diluita su una colonna di concentrazione (vedere Tabella dei materiali).
5. Eluire il [¹²⁵I]CLINDE dalla colonna con 300 μL di etanolo assoluto, quindi evaporare l'etanolo incubandolo in una centrifuga sottovuoto a RT per 40 minuti.
6. Diluire il residuo contenente il [¹²⁵I]CLINDE in 300 μL di soluzione salina sterile per creare una soluzione madre.
7. Dopo aver misurato la sua radioattività, diluire la soluzione madre in soluzione salina sterile per ottenere una soluzione di 0,037 MBq in 500 μL.
8. Purificare il tracciante mediante HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni). Determinare il tempo di eluizione utilizzando una calibrazione standard a 450 nm e isolare il singolo picco radioattivo. Eseguire la curva di calibrazione standard utilizzando sette concentrazioni standard di CLINDE freddo (non radioattivo) (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg e 5 μg in 400 μL di una soluzione al 50% ACN). Stabilire la purezza radiochimica misurando un singolo picco in radio TLC (thin layer chromatography). Assicurarsi che la purezza del radiochimico sia superiore al 60%.
9. Controllare l'attività specifica del radioligando misurando l'assorbanza ultravioletta a 450 nm e le curve di calibrazione stabilite con composti di riferimento freddi. Assicurarsi che l'attività specifica sia superiore a 1000 GBq/μmol.

4. [¹²⁵I]R91150 sintesi radiotracciante

NOTA: assicurarsi di seguire le stesse regole di sicurezza menzionate nella sezione di sintesi CLINDE.

1. Mescolare 300 μg di precursore R91150 in una soluzione di 3 μL di etanolo assoluto, 3 μL di acido acetico glaciale, 15 μL di Na¹²⁵I senza vettore (vedi Tabella dei materiali) (10 mCi) in 0,05 M NaOH e 3 μL di 30% H₂O₂. Incubare per 30 minuti in un vano portaoggetti.
2. Iniettare l'intera reazione in una colonna a fase inversa (vedere Tabella dei materiali).
3. Isolare [¹²⁵I]R91150 mediante funzionamento HPLC isocratico (ACN/acqua 50/50, tampone di acido acetico da 10 mM) con una portata di 3 ml/min.
4. Diluire [¹²⁵I]R91150 in H₂O per un volume finale di 10 mL.
5. Iniettare 10 mL della reazione diluita su una colonna di concentrazione (vedere Tabella dei materiali).
6. Elute [¹²⁵I]R91150 dalla colonna con 300 μL di etanolo assoluto.
7. Evaporare l'etanolo incubandolo in una centrifuga sottovuoto a RT per 40 min.
8. Diluire il residuo contenente [¹²⁵I]R91150 in 300 μL di soluzione salina.
9. Purificare il tracciante tramite HPLC. Determinare il tempo di eluizione utilizzando una calibrazione standard a 450 nm e isolare il singolo picco radioattivo. Stabilire la purezza radiochimica misurando un singolo picco in radio TLC. Assicurarsi che la purezza del radiochimico sia superiore al 98%.

5. Preparazione degli animali

1. Pesare e anestetizzare il ratto TgF344-AD (maschio o femmina, dai 2 ai 24 mesi) in una camera di induzione con il 3% di isoflurano. Una volta anestetizzato in profondità, abbassare il flusso di isoflurano al 2% (0,4 L/min, 100% O2) nella camera.
2. Posizionare l'animale su un letto preriscaldato dotato di un naso per anestesia. Mantenere l'isoflurano al 2% (0,4 L/min, 100% O₂).
3. Applicare il lubrificante gel per gli occhi negli occhi dell'animale e confermare la profondità dell'anestesia tramite monitoraggio respiratorio; regolare l'anestesia se necessario.
4. Eseguire l'inserimento del catetere 24 G nella vena della coda.

6. Acquisizione SPECT

1. Trasferire l'animale sul letto della telecamera dotato di una piastra riscaldante a temperatura controllata impostata su 38°C (Figura 1E).
2. Fissare la testa dell'animale sulla barra del morso e fissare i supporti della testa.
3. Imposta l'esperimento su una scansione di 60 minuti che costituisce 60 fotogrammi di 1 minuto. Riutilizzare tutti gli altri parametri impostati nel passaggio 1. Fare clic sul pulsante Aggiorna immagine per aggiornare la posizione dell'animale.
4. Imposta l'area di scansione facendo scorrere i cursori con l'aiuto delle tre immagini nella parte inferiore dello schermo per le tre dimensioni.
5. Iniettare 500 μL del radiotracciante radioattivo ([¹²⁵I]CLINDE o [¹²⁵I]R91150), quindi lavare il tubo con 300 μL di NaCl sterile allo 0,9%. Contemporaneamente fare clic su Avvia acquisizione per avviare la scansione.
6. Durante il tempo di scansione, assicurarsi di mantenere l'animale in anestesia costante con il monitoraggio della frequenza respiratoria. Regolare il flusso di isoflurano, se necessario.
7. Una volta terminata la scansione, eutanasizzare rapidamente l'animale anestetizzato per decapitazione.

7. Scansione della ricostruzione

1. Aprire il software di ricostruzione della scansione (vedere Tabella dei materiali), quindi aprire il set di dati, cercando il file [nomefile].parametri, creato nella cartella della scansione.
2. Selezionare l'isotopo di interesse. Si noti che il parametro Listmode consente la selezione di più isotopi in questo passaggio.
3. Selezionare i seguenti parametri: dimensione Voxel 0,4 mm, 4 sottoinsiemi (POS-EM), 6 iterazioni (equivalente 24ME-EM), nessun post-filtro e la corrispondente correzione del decadimento dell'isotopo. Selezionare il formato di output in NIfTI, quindi selezionare Avvia ricostruzione SPECT .

8. Estrazione del cervello di ratto

1. Nello stesso evento anestetico della procedura di scansione e dopo aver assicurato lo stato di anestesia profonda dell'animale monitorando la sua frequenza respiratoria, procedere alla decapitazione con ghigliottina e trasferire rapidamente la testa al banco di dissezione.
2. Con le forbici, tagliare con cura la pelle sulla parte superiore della testa dalla parte posteriore a quella anteriore fino al centro degli occhi.
3. Tagliare i muscoli in eccesso intorno alla base del cranio e alle vertebre cervicali.
4. Quindi, posizionare con attenzione una lama delle forbici nel foro nella parte posteriore del cranio, il forame magno, e rimuovere la parte posteriore del cranio con pinze chirurgiche.
5. Quindi, con le pinze chirurgiche, rimuovere con attenzione la parte superiore del cranio. Il cranio di vecchi ratti maschi può essere spesso, rimuovere come piccoli pezzi per evitare danni al cervello.
6. Tagliare con cura le meningi con le forbici. Le meningi possono danneggiare il cervello durante il processo di estrazione; rimuoverlo per precauzione.
7. Dopo aver rimosso la parte superiore del cranio, gira la testa dell'animale e, con una piccola spatola piatta, estrai con cura il cervello tagliando i nervi ottico e trigemino.
8. Trasferire con cura il cervello su una superficie di vetro piatta e pulita per la dissezione sul ghiaccio.
9. Usa una spatola metallica piatta e una lama di rasoio per sezionare le regioni di interesse del cervello. Posizionare i tessuti in un tubo di centrifuga da 2 ml e pesare il tessuto ottenuto. Utilizzare la sezione cerebrale direttamente per l'isolamento cellulare o congelarla rapidamente in azoto liquido per un uso successivo.

9. Isolamento cellulare

1. Assicurati di lavorare in un ambiente pulito e sterile. Si consiglia di lavorare sotto un armadio di biosicurezza di classe II (BSC). Assicurarsi che i guanti e ogni attrezzatura introdotta nel BSC siano sterili.
2. Per preparare le cellule per lo smistamento cellulare, seguire il protocollo di Jaclyn M. Schwarz¹⁴.
   NOTA: In questo esperimento, un kit di dissociazione neurale disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) è stato utilizzato per la preparazione cellulare.
   1. Mettere i campioni in un tubo di centrifuga da 2 ml con 1 mL di HBSS (Ca- e Mg-free), quindi centrifugare (300 x g, 2 min, temperatura ambiente = RT) e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.
   2. Aggiungere 1900 μL di miscela enzimatica-1 e incubarlo per 15 minuti a 37 °C mentre si agitano le provette per inversione ogni 5 minuti.
   3. Aggiungere 30 μL di miscela enzimatica-2, agitare delicatamente con la pipetta 1 (vedere Tabella dei materiali) avanti e indietro 30 volte. Quindi, incubare per 15 minuti a 37 °C mentre si agitano i tubi per inversione ogni 5 minuti.
   4. Mescolare delicatamente avanti e indietro con la pipetta 2, quindi la pipetta 3 prima di incubare per 10 minuti a 37 °C per dissociare i tessuti.
   5. Filtrare le celle con un filtro cellulare da 80 μm, aggiungere 10 ml di HBSS (Ca- e Mg-free). Centrifugare (300 x g, 10 min, RT) e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.
   6. Per l'esaurimento della mielina, risospesciare il pellet con 400 μL di tampone per la rimozione della mielina (vedere Tabella dei materiali), quindi aggiungere 100 μL di perle di rimozione della mielina (vedere Tabella dei materiali), prima di incubare per 15 minuti a 4 °C.
   7. Aggiungere 5 mL di tampone per la rimozione della mielina, centrifugare (300 x g, 10 min, RT) e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.
   8. Aggiungere 500 μL di tampone per la rimozione della mielina e posizionare il tubo nella colonna del campo magnetico. Lavare la colonna con 1 mL di tampone per la rimozione della mielina quattro volte.
   9. Centrifugare (300 x g, 2 min, RT) e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Vortice brevemente (2 s) per dissociare le cellule e aggiungere 5 μL di blocco Fc CD32. Vortice di nuovo e incubare per 5 minuti a 4 °C.
   10. Aggiungere 100 μL del mix di anticorpi primari di interesse; incubare per 20 minuti a 4 °C.
   11. Centrifugare (350 x g, 5 min, 4 °C) e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Tamponare i tubi a testa in giù su carta morbida.
   12. Dopo un breve vortice (2 s), aggiungere 100 μL della miscela di anticorpi secondari e incubare per 15 minuti a 4 °C.
   13. Aggiungere 2 mL di tampone per la rimozione della mielina, centrifugare (350 x g, 5 min, 4 °C) e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Tamponare i tubi a testa in giù su carta morbida. Risospese le cellule in 250 μL di PBS sterile e procedere direttamente alla selezione cellulare.

10. Ordinamento delle celle

1. Preparare il tubo del microfugo con 500 μL di PBS sterile per la raccolta delle cellule selezionate.
2. Aggiungere 10 μL di Hoechst per 1000 μL di soluzione cellulare per colorare i nuclei delle cellule viventi e distinguerli dalle cellule morte.
3. Trasferire le celle il prima possibile alla selezionatrice a 4 °C.
4. In primo luogo, ordinare le celle per dispersione in avanti e laterale, quindi ordinare le celle positive di Hoechst. Quindi, ordina le cellule in base agli anticorpi di interesse. Raccogliere separatamente le cellule macchiate positivamente. Assicurati di distinguere le cellule positive da quelle autofluorescenti.
5. Contare il numero di celle ordinate per ogni pool di interesse.

11. Conteggio gamma

1. Calibrare il sistema di conteggio γ con 10 μL della stessa soluzione fantasma utilizzata per la calibrazione SPECT ma diluirlo in 1 mL di acqua.
   NOTA: la soluzione fantasma viene diluita grazie alla maggiore precisione del sistema di conteggio γ.
2. Posizionare il tubo delle celle selezionate nel sistema di conteggio γ e procedere con il conteggio γ secondo il protocollo del produttore.

I ratti WT hanno sperimentato la scansione SPECT in vivo con radiotracciante [125I]CLINDE dopo un'iniezione unilaterale di LPS (Figura 2). Questa scansione (utilizzando dati sommati da immagini di 45-60 minuti dopo l'iniezione di radiotraccianti) ha mostrato un legame più elevato di [125I]CLINDE nel sito dell'iniezione LPS (Figura 2A) rispetto alla regione controlaterale del cervello (Figura 2B). I campioni ex vivo sottoposti a FACS-RTT hanno confermato questi risultati e hanno rivelato la presenza di un numero maggiore di siti di legame [125I]CLINDE solo nelle microglia, dimostrando che l'origine cellulare del segnale [125I]CLINDE nel lato ipsilaterale del cervello era microgliale (Figura 3A)15.

Utilizzando lo stesso radiotracciante [125I]CLINDE, il protocollo è stato quindi eseguito sull'ippocampo di vecchi ratti TgF344-AD (di 12 e 24 mesi) e confrontato con WT di 24 mesi. I risultati hanno dimostrato che l'aumento del legame TSPO a 12 mesi nei ratti TgF344-AD era limitato agli astrociti. Nei ratti di 24 mesi, l'aumento del legame TSPO era dovuto ad alterazioni sia astrocitiche che microgliali (Figura 3B). I risultati hanno mostrato che la sovraespressione di TSPO negli astrociti è probabilmente osservata prima di quella microgliale. Indipendentemente, utilizzando il radiotracciante [125I]R91150, questa tecnica è stata utilizzata su scala cellulare per dimostrare che nei ratti TgF344-AD più vecchi, gli astrociti striatali mostravano una diminuzione della densità 5HT2AR rispetto a WT (Figura 3C)16.

Infine, FACS-RTT è stato eseguito su campioni umani di AD post-mortem. Dopo la dissociazione, le cellule sono state incubate con [125I]CLINDE prima della colorazione e della procedura FACS. Ciò ha permesso di scoprire una sovraespressione corticale di TSPO sia negli astrociti che nelle microglia dei soggetti ad AD rispetto ai controlli di pari età (Figura 3D).

Figura 1: Configurazione della telecamera SPECT. (A) Presentazione generale della telecamera SPECT. (B) Presentazione del letto con riscaldamento e monitoraggio della frequenza respiratoria. (C) Tappi per tubi per anestesia. (D) Letto riscaldante e presa della sonda respiratoria. (E) Vista di monitoraggio del posizionamento fantasma dal software. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Imaging cerebrale TSPO utilizzando SPECT con radiotracciante [125I]CLINDE. Immagini rappresentative (45-60 min post-iniezione di [125I]CLINDE) dell'ippocampo dopo (A) LPS o (B) iniezione salina nel lato ipsilaterale (bianco) e controlaterale (rosso) del cervello. Le curve tempo-attività in vivo misurate nel volume di interesse sono rappresentate nel pannello di destra. SPECT: tomografia computerizzata ad emissione di singolo fotone; TSPO: proteina traslocatrice; LPS: lipopolisaccaride. n = 7 animali per condizione. Questa cifra è stata modificata da Tournier et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Quantificazione di TSPO e 5HT2AR. (A) Origine cellulare della sovraespressione di TSPO dopo un'iniezione cerebrale unilaterale di LPS. La radioattività è stata misurata (% dose iniettata/g di tessuto) in ciascuna popolazione cellulare nel lato controlaterale (grigio, n = 7) e ipsilaterale (verde, n = 7) dell'iniezione. Test statistico utilizzato: t-test accoppiato. (B) TSPO nel vecchio ratto TgF344-AD. Le concentrazioni di [125I]CLINDE (% dose iniettata/g di tessuto) sono state determinate in animali selvatici di 24 mesi (grigio, n = 9) e in ratti TgF344- AD di 12 anni (verde, n = 8) e di 24 mesi (viola, n = 7). Test statistico utilizzato: ANOVA bidirezionale. (C) 5HT2AR è diminuito negli astrociti dello striato nei vecchi ratti TgF344-AD. La concentrazione di [125I]R91150 è stata determinata negli astrociti e nelle microglia a livello cellulare (% dose iniettata/cellula) nei ratti WT (grigio, n = 7) e vecchi TgF344-AD (verde, n = 11). Test statistico utilizzato: ANOVA unidirezionale. (D) Provenienza cellulare della sovraespressione di TSPO nella corteccia frontale nella malattia di Alzheimer (AD). In ogni popolazione cellulare, la radioattività viene misurata (% dose iniettata/g di tessuto) in soggetti AD (verde, n = 9) e di controllo (grigio, n = 9). Test statistico utilizzato: t-test spaiato. Tutti i dati sono rappresentati come ± IC 95% con la seguente annotazione: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.