Progettazione e sviluppo di un modello per studiare l'effetto dell'ossigeno supplementare sul microbioma delle vie aeree della fibrosi cistica

Summary

L'obiettivo di questo protocollo è quello di sviluppare un sistema modello per l'effetto dell'iperossia sulle comunità microbiche delle vie aeree della fibrosi cistica. Il mezzo espettorato artificiale emula la composizione dell'espettorato e le condizioni di coltura iperossica modellano gli effetti dell'ossigeno supplementare sulle comunità microbiche polmonari.

Abstract

Si ritiene che le comunità microbiche delle vie aeree svolgano un ruolo importante nella progressione della fibrosi cistica (FC) e di altre malattie polmonari croniche. I microbi sono stati tradizionalmente classificati in base alla loro capacità di utilizzare o tollerare l'ossigeno. L'ossigeno supplementare è una terapia medica comune somministrata a persone con fibrosi cistica (pwCF); tuttavia, gli studi esistenti sull'ossigeno e sul microbioma delle vie aeree si sono concentrati su come l'ipossia (basso livello di ossigeno) piuttosto che l'iperossia (alto livello di ossigeno) colpisce le comunità microbiche polmonari anaerobiche prevalentemente aerobiche e facoltative. Per affrontare questa lacuna critica di conoscenza, questo protocollo è stato sviluppato utilizzando un mezzo espettorato artificiale che imita la composizione dell'espettorato da pwCF. L'uso della sterilizzazione con filtro, che produce un mezzo trasparente, consente ai metodi ottici di seguire la crescita di microbi unicellulari in colture in sospensione. Per creare condizioni iperossiche, questo sistema modello sfrutta le tecniche di coltivazione anaerobica consolidate per studiare le condizioni iperossiche; invece di rimuovere l'ossigeno, l'ossigeno viene aggiunto alle colture mediante spargimento quotidiano di flaconi di siero con una miscela di ossigeno compresso e aria. L'espettorato da 50 pwCF è stato sottoposto a sparging giornaliero per un periodo di 72 ore per verificare la capacità di questo modello di mantenere condizioni di ossigeno differenziale. Il sequenziamento metagenomico shotgun è stato eseguito su campioni di espettorato in coltura e non coltivati da 11 pwCF per verificare la capacità di questo mezzo di supportare la crescita di microbi commensali e patogeni comunemente presenti nell'espettorato della fibrosi cistica. Le curve di crescita sono state ottenute da 112 isolati ottenuti da pwCF per verificare la capacità di questo mezzo espettorato artificiale di supportare la crescita di comuni patogeni della fibrosi cistica. Troviamo che questo modello può coltivare un'ampia varietà di agenti patogeni e commensali nell'espettorato CF, recupera una comunità molto simile all'espettorato non coltivato in condizioni normossiche e crea diversi fenotipi di coltura in condizioni di ossigeno variabili. Questo nuovo approccio potrebbe portare a una migliore comprensione degli effetti imprevisti indotti dall'uso di ossigeno in pwCF sulle comunità microbiche delle vie aeree e sui comuni patogeni respiratori.

Introduction

La fibrosi cistica (FC) è una malattia genetica caratterizzata dall'incapacità di eliminare il muco denso dai polmoni, che porta a infezioni ripetute e progressivo declino della funzione polmonare che spesso si traduce nella necessità di trapianto di polmone o morte. Il microbioma delle vie aeree delle persone con fibrosi cistica (pwCF) sembra tracciare l'attività della malattia¹, con una riduzione della diversità microbica associata a esiti avversi a lungo termine^2,3. Negli studi clinici di pwCF, l'ossigenoterapia supplementare è stata associata alla malattia più avanzata^4,5, anche se tradizionalmente, l'uso dell'ossigenoterapia è stato visto semplicemente come un marcatore per la gravità della malattia⁶. Recenti studi di uno studio clinico su pazienti con insufficienza respiratoria hanno dimostrato che livelli più elevati di ossigeno nei pazienti sono paradossalmente associati ad un aumento delle infezioni batteriche gravi e ad una maggiore mortalità⁷, suggerendo che l'ossigeno supplementare può contribuire alla patogenesi della malattia. L'effetto dell'ossigeno supplementare sul microbioma polmonare della fibrosi cistica e sulle comunità microbiche polmonari e aeree associate non è stato ben studiato.

Gli studi meccanicistici spesso non possono essere eseguiti direttamente su soggetti umani a causa di difficoltà logistiche e potenziali problemi etici associati a interventi di beneficio o danno medico sconosciuto. Gli approcci traslazionali che integrano i biocampioni umani in sistemi modello possono offrire importanti intuizioni biologiche in questi casi. Mentre la capacità di utilizzare o tollerare l'ossigeno è stata tradizionalmente una componente importante della classificazione microbica, poco si sa su come l'introduzione terapeutica di ossigeno supplementare nell'ambiente potrebbe perturbare le comunità microbiche delle vie aeree. Per far luce sugli effetti sconosciuti dell'ossigeno supplementare sui microbiomi delle vie aeree di pwCF, dovevamo affrontare due sfide principali; in primo luogo, la creazione di un terreno di coltura che approssima fisiologicamente la composizione dell'espettorato CF; in secondo luogo, la creazione di un sistema modello che consenta il mantenimento di elevate concentrazioni di ossigeno in coltura per lunghi periodi di tempo.

I mezzi di espettorato artificiale (ASM) sono ampiamente utilizzati per emulare l'espettorato polmonare ex vivo^8,9,10, ma non esiste un chiaro consenso su una ricetta specifica. Questo protocollo descrive una ricetta e una strategia di preparazione del mezzo espettorato artificiale attentamente progettata per approssimare fisiologicamente l'espettorato da pwCF. La Tabella 1 delinea i valori delle ricette scelte in base alla letteratura pubblicata. I componenti chimici di base e il pH sono stati abbinati ai valori identificati dagli studi sull'espettorato CF umano^11,12,13. Nutrienti fisiologici a bassa concentrazione sono stati aggiunti utilizzando il tuorlo d'uovo, che è stato incluso come 0,25% del volume finale¹⁰, così come le miscele di vitamine e tracce^{metalliche 14,15}. La mucina, il componente chiave dell'espettorato^16,è stata inclusa all'1% p/v^14. Sebbene più laboriosa, la sterilizzazione con filtro è stata scelta rispetto alla pratica più convenzionale della sterilizzazione a caldo per ridurre i potenziali problemi derivanti dalla denaturazione indotta dal calore dei componenti essenziali dei mezzi¹⁰. Un ulteriore vantaggio della sterilizzazione con filtro è che genera mezzi trasparenti (la sterilizzazione a caldo può creare mezzi torbidi a causa della precipitazione e della coagulazione di sali e proteine), consentendo a questo mezzo espettorato artificiale di essere utilizzato per seguire la crescita microbica in base all'aumento della torbidità.

Questo sistema modello per la coltura iperossica si basa su tecniche di coltivazione anaerobica in cui l'ossigeno viene aggiunto piuttosto che rimosso, creando un modello per l'effetto dell'uso supplementare di ossigeno per pwCF. La Figura 1 e il protocollo di sparging dell'ossigeno associato delineano i componenti di un sistema di sparging di ossigeno, che può essere ottenuto a basso costo da fornitori generali di laboratorio e ospedalieri. Questo sistema consente la miscelazione di ossigeno compresso e aria a concentrazioni fisse che vanno dal 21% al 100% di ossigeno. L'integrazione di un sensore di ossigeno consente la verifica della concentrazione della miscela di gas in uscita, nonché il controllo della composizione del gas di deflusso di bombole di siero precedentemente spargate per verificare che le condizioni di ossigeno siano state mantenute entro l'intervallo desiderato.

Questo protocollo delinea le procedure per creare un mezzo espettorato artificiale, la costruzione e l'uso di un sistema di spargimento di ossigeno e l'applicazione di entrambi per coltivare l'espettorato CF in condizioni di ossigeno differenziale.

Protocol

Questo studio ha ricevuto l'approvazione del Partners Institutional Review Board (Protocollo # 2018P002934). Il criterio di inclusione includeva pazienti adulti con fibrosi cistica che hanno fornito il consenso informato scritto per lo studio. Non esisteva un criterio di esclusione. Secondo le linee guida del protocollo, tutti i campioni di espettorato sono stati raccolti da pazienti con fibrosi cistica durante una visita ambulatoriale programmata con il loro fornitore clinico.

1. Preparazione del mezzo espettorato artificiale

NOTA: Le quantità qui elencate sono per la produzione di 1 L di mezzo espettorato artificiale finale e assumono i reagenti specifici elencati nella Tabella dei materiali. I numeri devono essere adeguati per altri volumi o per l'uso di reagenti diversi per garantire lo stesso prodotto finale. Vedere tabella 1 per le concentrazioni target.

1. Miscela chimica artificiale di espettorato (ASCM)
   NOTA: ASCM costituisce il 25% del volume medio finale. È stabile a scaffale e può essere preparato alla rinfusa o in anticipo. Se si sta preparando per un uso successivo, autoclavare la miscela chimica e conservarla in modo sicuro a temperatura ambiente.
   1. Mescolare le soluzioni di riserva chimica costituenti.
      1. Preparare 1 M di Brodo di NaCl: Aggiungere 58,44 g di NaCl per litro di acqua sterile.
      2. Preparare 1 M KCl stock: Aggiungere 74,55 g di KCl per litro di acqua sterile.
      3. Preparare 1 M MgSO₄ stock: Aggiungere 246,47 g di MgSO₄·7H₂O per litro di acqua sterile o 120,37 g di MgSO4 anidro per litro di acqua sterile.
      4. Preparare 1 M di brodo di glucosio: aggiungere 180,16 g di glucosio per litro di acqua sterile.
   2. L'autoclave sterilizza le soluzioni di riserva chimica e una bottiglia vuota da 250 ml. Eseguire le fasi di autoclave ad almeno valori standard di 121 °C e 15 PSI per 30 min.
   3. Aggiungere 80,59 ml di acqua sterile alla bottiglia vuota da 250 ml.
   4. Aggiungere 152,30 ml di 1 M Di NaCl alla miscela.
   5. Aggiungere 15,8 ml di stock di 1 M KCl al mix.
   6. Aggiungere 610 μL di 1 M MgSO₄ stock alla miscela.
   7. Aggiungere 700 μL di 1 M di brodo di glucosio alla miscela.
2. Miscela di mucina artificiale di espettorato (ASMM)
   NOTA: ASMM costituisce il 50% del volume medio finale. Assicurarsi che sia preparato lo stesso giorno del lotto medio finale.
   1. Aggiungere 450 ml di acqua sterile in una bottiglia vuota da 1 L.
   2. Aggiungere 50 ml di 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) al flacone.
   3. Aggiungere una barra magnetica monouso alla bottiglia.
   4. Autoclave la bottiglia contenente PBS e la barra di agitazione.
   5. Misurare 10 g di mucina in polvere e aggiungerlo al PBS.
   6. Agitare vigorosamente la bottiglia per la miscelazione preliminare.
   7. Posizionare la bottiglia su una piastra calda con un agitatore magnetico. Impostare il calore su medio-alto puntando a 50 °C e la velocità di agitazione a 1100 giri/min. Aumentare gradualmente la velocità in modo che la barra non voli via dal magnete.
      1. Lasciare scaldare e mescolare per 15 min.
      2. Raccogli la bottiglia con guanti resistenti al calore. Osservare per verificare se la polvere di mucina si deposita fuori dalla soluzione.
      3. Se la polvere di mucina non è completamente sciolta, riportare la bottiglia a caldo / agitatore per intervalli di 5 minuti fino a quando non è completamente sciolta.
   8. Lasciare raffreddare la miscela di mucina a temperatura ambiente.
3. Miscela biologica di espettorato artificiale (ASBM)
   NOTA: ASBM è il 25% del volume medio finale. Prepararlo lo stesso giorno del lotto medio finale e, a differenza delle altre miscele, non esporre i suoi componenti a calore.
   1. Scongelare il brodo vitaminico 100x in un frigorifero a 4 °C o sul ghiaccio.
      NOTA: Pre-porzionare lo stock vitaminico in aliquote da 10 ml per ridurre al minimo il numero di cicli di congelamento/scongelamento.
   2. Aggiungere 124,24 ml di acqua sterile alla bottiglia vuota da 250 mL autoclavata.
   3. Aggiungere 25,76 ml di 50x aminoacidi essenziali alla miscela.
   4. Aggiungere 80,14 ml di 100x di aminoacidi non essenziali alla miscela.
   5. Aggiungere 10 ml di (scongelato) 100x brodo vitaminico al mix.
   6. Aggiungere 1 mL di 1000x stock di metalli in traccia al mix.
   7. Aggiungere 8,33 ml di emulsione di tuorlo d'uovo al 30% alla miscela.
   8. Aggiungere 400 μL di 10 g/L di ferritina alla miscela.
   9. Mescolare bene la soluzione agitando manualmente.
4. Mezzo espettorato artificiale (ASM)
   1. Aggiungere 250 ml di ASCM al flacone da 1 L contenente ASMM.
   2. Aggiungere 250 ml di ASBM al flacone medio.
   3. Titolare il mezzo con tampone MOPS di base (1 M) per raggiungere un pH di 6,3 su una carta a pH di intervallo ristretto. Prima della titolazione, la miscela media sarà troppo acida.
   4. Conservare in frigorifero il mezzo espettorato artificiale risultante a 4 °C fino a quando non è pronto per la filtrazione.
   5. Per avviare il processo di filtrazione, trasferire 200 ml di terreno espettorato artificiale non filtrato a un sistema di filtrazione a vuoto con un filtro di dimensioni dei pori di 0,22 μm.
   6. Collegare il sistema di filtrazione alla pompa per vuoto, accendere la pompa per vuoto, impostarla su 70 mbar, quindi posizionare la camera su uno shaker orbitale che scuote a 90 giri / min in una cella frigorifera a 4 ° C.
      1. Completare con ulteriori 150 ml del mezzo mentre viene filtrata una quantità apprezzabile. Ci vogliono 1-2 giorni per filtrare completamente 1 L di mezzo.
      2. Ripetere con camere aggiuntive fino a quando tutti i supporti non vengono filtrati.
         NOTA: Cercare di non filtrare più di 350 ml del mezzo attraverso lo stesso filtro da 0,22 μm poiché la mucina collegherà il filtro nel tempo.
   7. Conservare in frigorifero il mezzo di espettorato artificiale filtrato a 4 °C fino al momento dell'uso. Utilizzare ASM entro un mese dalla preparazione per ottenere i migliori risultati.

2. Sparging di ossigeno

1. Configurazione della stazione di sparging
   NOTA: questo protocollo deve essere eseguito per intero una sola volta, dopodiché l'installazione può essere mantenuta attraverso una semplice manutenzione, se necessario. Vedere la Figura 1 per uno schema visivo del sistema di spargimento di ossigeno.
   1. Ottenere e fissare correttamente i serbatoi di aria compressa e ossigeno.
      ATTENZIONE: l'alta pressione rende i serbatoi estremamente pericolosi se mal gestiti. Assicurarsi che i serbatoi siano completamente sigillati e fissati, che non ci siano perdite quando il serbatoio è chiuso e che tutto il personale di movimentazione sia completamente addestrato al loro utilizzo.
   2. Collegare un regolatore d'aria al serbatoio dell'aria compressa con una chiave inglese. Per una lettura ottimale del flusso sul regolatore, collegare il regolatore il più vicino possibile a una posizione verticale.
   3. Collegare un regolatore di ossigeno al serbatoio di ossigeno compresso, collegandolo il più vicino possibile a una posizione verticale. A seconda del serbatoio di ossigeno, potrebbe essere necessario invertire la direzione per stringere.
   4. Collegare il tubo dai regolatori a un connettore a Y per combinare il flusso di gas dai due serbatoi.
   5. Collegare l'uscita del connettore a Y alla valvola centrale di giunzione a T.
   6. Collegare un lato della valvola centrale a giunzione a T a un manometro del gas.
   7. Collegare l'altro lato del manometro del gas a un filtro a siringa sterile di 25 mm di diametro con una dimensione dei pori di 0,22 μm.
   8. Collegare un secondo filtro a siringa da 25 mm di diametro a una siringa senza stantuffo da utilizzare come rilascio di gas durante lo sparging.
   9. Collegare il lato finale della valvola centrale a giunzione a T a una seconda valvola di giunzione a T per il monitor dell'ossigeno.
   10. Collegare un filtro a siringa da 25 mm di diametro su un lato di questa seconda valvola a giunzione a T, insieme al tubo per fissare aghi da 18 G.
   11. Collegare il lato finale della seconda valvola a giunzione a T all'apparecchiatura di monitoraggio dell'ossigeno.
   12. Collegare un tubo di interruzione all'altro lato dell'apparecchiatura di monitoraggio dell'ossigeno da utilizzare come rilascio di gas durante il monitoraggio.
       ATTENZIONE: durante il test/l'utilizzo del sistema di sparging dell'ossigeno, prendere nota della posizione delle giunzioni a T e assicurarsi che corrisponda al percorso previsto attraverso il sistema. In caso contrario, si verificherà un accumulo di pressione all'interno del sistema e causerà il guasto e la rottura dei componenti.
   13. Per la manutenzione del sistema e per mantenerlo funzionante a prestazioni ottimali, le seguenti pratiche sono utili.
       1. Rinforzare le connessioni con quantità liberali di nastro in Teflon per migliorare notevolmente la loro tenuta e ridurre la possibilità che i componenti si allontanino dalla pressione interna.
       2. Mantenere la portata combinata al di sotto di 10 L/min per mitigare la pressione massima e prevenire guasti.
       3. Se si sospetta una perdita, utilizzare una soluzione detergente come rilevatori di perdite di liquidi disponibili in commercio per identificarne facilmente la posizione, poiché bollerà al di sopra di eventuali perdite di gas. Perdite di patch utilizzando un nastro in politetrafluoroetilene (ad esempio, Teflon).
       4. Sostituire i filtri a siringa da 25 mm di diametro nel sistema di sparging dell'ossigeno due volte alla settimana, ma questo varia con la frequenza d'uso. Nel corso del tempo, le particelle catturate nel filtro riducono la portata del gas e causano accumuli di pressione.
       5. Calibrare il monitor dell'ossigeno al 21% di aria compressa di ossigeno prima di effettuare le misurazioni.
       6. Al termine dell'uso del sistema, spegnere i serbatoi e spurgare il gas in eccesso dai regolatori fino a quando il flusso non si arresta completamente.
2. Siero bottiglia coltura sparging
   1. Etichettare flaconi di siero autoclavati da 500 ml con identificatori del campione, data / ora di inoculazione e percentuale di ossigeno target.
   2. In una cappa biologica, aggiungere 24 ml di terreno espettorato artificiale a ciascun flacone di siero in fase di installazione.
   3. Aggiungere 1 mL dell'espettorato del paziente omogeneizzato con un ago da 18 G (diluito con soluzione salina sterile se necessario per ottenere un volume sufficiente di campione per ogni condizione di coltura) a ciascun flacone di siero.
   4. Utilizzando una pinzetta sterile, posizionare i tappi di gomma autoclavati sulla parte superiore di ogni flacone di siero.
   5. Premere verso il basso i tappi di gomma, fare attenzione a non toccare la parte inferiore del tappo con le mani.
   6. Rimuovere le bottiglie dal cappuccio, applicare e crimpare i sigilli in alluminio. Rimuovere il pezzo centrale dai sigilli.
   7. Pulire la parte superiore delle bottiglie con una salvietta imbevuta di alcol e passarle attraverso una fiamma del bruciatore Bunsen.
   8. Applicare un ago sterile da 18 G su una siringa senza stantuffo con un filtro. Inserire prima questo rilascio di gas nella bottiglia.
   9. Applicare un ago sterile da 18 G all'uscita del gas dal sistema e inserire anche l'ago di uscita del gas nella bottiglia.
   10. Instradare le giunzioni a T dai serbatoi attraverso il monitor dell'ossigeno. Verificare che la concentrazione di ossigeno target scorra attraverso il sistema. Target di circa 5 L/min di flusso di gas.
   11. Reindirizzare le giunzioni a T dai serbatoi fino all'uscita del gas. Il gas inizia a fluire attraverso la bottiglia di siero.
       ATTENZIONE: Prestare molta attenzione al manometro durante lo spargimento di ossigeno. Se la pressione aumenta inaspettatamente, spegnere immediatamente il sistema.
   12. Eseguire lo sparge di ossigeno attraverso il flacone del siero per 1 minuto. A 5 L/min, ciò consente 10 ricambi d'aria e garantisce che l'atmosfera interna raggiunga la pressione parziale desiderata.
   13. Rimuovere l'ago da 18 G a rilascio di gas.
   14. Lasciare che la pressione nel flacone del siero si accumuli a +1 atmosfera (2 atmosfere a livello del mare) e quindi rimuovere immediatamente l'ago di uscita del gas.
       NOTA: Mantenimento della ritenzione degli ausili a pressione delle condizioni iperossiche nel tempo.
   15. Posizionare il flacone di siero in uno shaker incubatore a 37 °C a 150 giri/min. Incubare i campioni per tre intervalli di 24 ore. Ad ogni intervallo di 24 ore, prelevare un'aliquota per l'analisi a valle, rifare i campioni e riportarli in incubazione per un tempo totale di incubazione di 72 ore.
3. Misurazione dell'ossigeno di deflusso
   1. Calibrare il misuratore di ossigeno al 21% di aria compressa, quindi spegnere il serbatoio.
   2. Instradare l'assunzione del flacone di siero attraverso il monitor dell'ossigeno e apporre un ago sterile all'estremità.
   3. Inserire l'ago attraverso il tappo di gomma nel flacone del siero.
   4. Attendere che la lettura del deflusso si stabilizzi. Una bassa portata fuori dai flaconi di siero significa che questo può richiedere fino a 2 minuti. Segnala la differenza di picco dall'aria ambiente (numero più lontano dal 21%).
   5. Se si eseguono più letture, lavare il sistema con aria compressa tra le letture.

Results

Questi protocolli sono stati applicati a 50 campioni di espettorato da pwCF che si presentano per cure di routine a una clinica ambulatoriale per la fibrosi cistica presso il Massachusetts General Hospital di Boston, Massachusetts. L'espettorato di ogni paziente è stato coltivato in condizioni di ossigeno al 21%, 50% e 100% utilizzando il mezzo artificiale dell'espettorato, con aliquote di 0,5 ml prelevate da ciascuna coltura a 24 ore, 48 ore e 72 ore di tempo di coltura per il test. Le culture sono state fotografate qua...

Discussion

In questo studio, è stato sviluppato un modello in vitro per studiare l'effetto dell'iperossia sulle comunità microbiche polmonari. Questo modello, basato sul mezzo espettorato artificiale e sullo spargimento giornaliero di flaconi di siero, mantiene elevate concentrazioni di ossigeno e supporta la crescita dei microbi identificati nell'espettorato da pwCF.

Ci sono diversi passaggi critici di questo approccio. Il primo è la scelta di utilizzare la sterilizzazione con filtro piuttosto ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BME Vitamine (100x) Soluzione	MilliporeSigma	B6891	Soluzione concentrata di vitamine supplementari.
Crimper, 30 mm	DWK Life Sciences	224307	Crimper per il fissaggio di sigilli in alluminio ai flaconi di siero.
D-(+)-	Glucosio MilliporoSigma	G7021	Glucosio solido in polvere (isomero destrogiro).
Pompa a membrana ME 2 NT	VACUUBRAND 20730003		Pompa per vuoto per filtrazione sotto vuoto.
Emulsione Tuorlo d'Uovo	HiMedia	FD045	Emulsione sterile di tuorlo d'uovo al 30% in soluzione fisiologica.
Ferritina, cationizzata da milza di cavallo	MilliporeSigma	F7879	Ferritina (proteina di stoccaggio del ferro).
Bruciatore Bunsen di sicurezza FIREBOY plus Bruciatore Bunsen	Integra Biosciences	144000	con interfaccia utente e funzioni di sicurezza.
Carta pH Hydrion (1,0– 14.0)	Micro Essential Laboratory	94	carta per test del pH per l'intervallo di 1,0 e 14,0.
Carta pH Hydrion (4.0– 9.0)	Micro Essential Laboratory	55	carta per test del pH per l'intervallo di 4.0–9.0.
Carta pH Hydrion (6,0– 8.0)	Micro Essential Laboratory	345	carta per test di pH per l'intervallo di 6,0 – 8,0.
Dispositivo di sicurezza Hypodermic Needle-Pro EDGE, aghi da 18 G	Smiths Medical	401815	da 18 G con tappi di sicurezza.
Manometro in linea	MilliporeSigma	20469	Manometro per gas per il monitoraggio della pressione delle bombole.
Innova 42 Agitatore incubato	Eppendorf	2231000756	Incubatore combinato/agitatore orbitale.
Siringa Luer-Lok con ago collegato	Becton Dickinson	309580	Siringa combinata da 3 ml e ago da 18 G.
Assortimento di valvole Luer World	Precision Instruments	14011	Valvole per tubi di flusso del gas.
Agitatore orbitale LSE	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Agitatore orbitale per agitare i fluidi durante la filtrazione.
Solfato di magnesio eptaidrato	MilliporeSigma	M2773	Sale epsom solido (solfato di magnesio eptaidrato).
Regolatore monostadio per aria medica con flussometro	Western Enterprises	M1-346-15FM	Regolatore di portata d'aria con misuratore da 15 L/min.
MEM Aminoacidi (50x) Soluzione	MilliporeSigma	M5550	Soluzione concentrata di aminoacidi essenziali.
MEM Soluzione di Aminoacidi Non Essenziali (100x)	MilliporeSigma	M7145	Soluzione concentrata di aminoacidi non essenziali.
Filtro Millex-GP, 0,22 &; micro; m	MilliporeSigma	SLMP25SS	0,22 µ m filtro per siringa sterile con membrana in polietersulfone.
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	sistema di filtrazione dell'acqua sterile Milli-Q.
Monitor di ossigeno MiniOX 3000	MSA	814365	Monitor della percentuale di ossigeno del flusso di gas.
Tampone MOPS (1 m, pH 9,0)	Boston BioProducts	BBM-90	Tampone MOPS per la regolazione del pH dei terreni.
Mucina da stomaco suino	MilliporeSigma	M2378	Mucina (proteina gelificante glicosilata) in polvere.
Kit di raccordi spinati in polipropilene naturale	Harvard Apparatus	72-1413	Connettori per tubi di flusso del gas.
Kit di preparazione della libreria di DNA Nextera XT	Illumina	FC-131-1096	Preparazione della libreria per l'identificazione durante il sequenziamento.
Sistema di sequenziamento NovaSeq 6000	Illumina	770-2016-025-N	Piattaforma di sequenziamento shotgun per la generazione di letture di campioni.
Regolatore monostadio di ossigeno con flussometro	Western Enterprises	M1-540-15FM	Regolatore di portata di ossigeno con misuratore da 15 L/min.
Tubo dell'ossigeno con 2 connettori standard	SunMed	2001-01	Tubo per il collegamento dei componenti del sistema del gas.
Soluzione salina tamponata con fosfato, 10x, pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	Soluzione salina concentrata tamponata con fosfato.
PC 420 Piastra riscaldante/agitatore	Marshall Scientific	CO-PC420	Combinazione piastra/agitatore.
Cloruro di potassio	MilliporeSigma	P9541	Sale solido di cloruro di potassio.
Ancorette monouso in PTFE	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Ancorette magnetiche monouso.
Nastro in teflon con guarnizione filettata in PTFE	VWR	470042-938	Nastro in teflon per rinforzare i collegamenti del sistema del gas.
Cartuccia di purificazione Q-Gard 2	MilliporeSigma	QGARD00D2	Cartuccia di purificazione per sistema Milli-Q.
Bottiglie riutilizzabili per la conservazione dei terreni	ThermoFisher Scientific	06-423A	Bottiglie per la miscelazione e la conservazione dei terreni di coltura.
Tappo in gomma, 30 mm, grigio bromobutile	DWK Life Sciences	224100-331	Tappi in gomma per flaconi di siero.
Flacone di siero con graduazioni stampate, 500 mL	DWK Life Sciences	223952	Flaconi di siero in vetro per colture sigillate.
Set di prolunga per fori piccoli	Braun Medical	471960	Prolunga per tubi con connettori luer lock.
Cloruro di Sodio	MilliporeSigma	S3014	Sale solido di cloruro di sodio.
Spike-in Control I (Alta carica microbica)	ZymoBIOMICS	D6320	Microbi spike-in (I. halotolerans e A. halotolerans) per il calcolo della carica microbica assoluta Sistema
filtrazione sottovuoto sterile a sgancio rapido Stericup	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0,22 &; M Camera di filtrazione sottovuoto.
Salviette monouso germicide Super Sani-Cloth Monouso	professionali International	H04082	Salviette germicide monouso per sterilizzazione.
Miscela di Metalli Tracce, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Soluzione concentrata di metalli in tracce fisiologiche.
Guarnizione in alluminio non rivestita, 30 mm	DWK Life Sciences	224187-01	Guarnizioni in alluminio crimpate sopra i tappi in gomma.
Serbatoio d'aria per uso medico USP Airgas		AI USP200	Serbatoio d'aria compressa per l'ingresso al sistema di sparging.
Serbatoio di ossigeno per uso medico USP Airgas		OX USP200	Serbatoio di ossigeno compresso per l'ingresso al sistema di sparging.