Metodo ad alta produttività, robusto e altamente flessibile nel tempo per la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsis

Summary

Viene fornito un protocollo ad alto rendimento per la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), ottimizzando le fasi di movimentazione del liquido con un semplice dispositivo di aspirazione costruito con una pompa per vuoto. Centinaia di campioni di semi possono essere sterilizzati in superficie in un giorno.

Abstract

Arabidopsis è di gran lunga la specie modello vegetale più utilizzata per gli studi funzionali. La sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsis è un passo fondamentale in questa direzione. Pertanto, è fondamentale stabilire metodi di sterilizzazione superficiale dei semi arabidopsis ad alto rendimento per gestire da decine a centinaia di campioni (ad esempio, linee transgeniche, ecotipi o mutanti) contemporaneamente. In questo studio viene presentato un metodo di sterilizzazione della superficie dei semi basato sull'eliminazione efficiente del liquido nei tubi con un dispositivo di aspirazione fatto in casa costruito da una comune pompa per vuoto. Riducendo drasticamente il tempo di hands-on ad alta intensità di lavoro con questo metodo, è possibile gestire diverse centinaia di campioni in un giorno con poco sforzo. Le analisi del decorso temporale in serie hanno inoltre indicato un intervallo di tempo altamente flessibile di sterilizzazione superficiale mantenendo alti tassi di germinazione. Questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per la sterilizzazione superficiale di altri tipi di piccoli semi con una semplice personalizzazione del dispositivo di aspirazione in base alle dimensioni del seme e alla velocità desiderata per eliminare il liquido.

Introduction

Arabidopsis è una specie vegetale diploide appartenente alla famiglia delle Brassicaceae. Il suo ciclo di vita relativamente breve (due mesi per generazione in condizioni di crescita di lunga giornata), le piccole dimensioni delle piante e l'autoimpollinazione con la produzione di centinaia di semi per pianta ne hanno fatto la prima specie modello vegetale fondamentale^1,2. Inoltre, il suo genoma è stato completamente sequenziato³, ampi strumenti di genetica inversa (T-DNA saturo, trasposone e popolazioni chimicamente mutagenizzate) sono disponibili^4,

Protocol

1. Reagenti e preparazione dei supporti

1. Preparare la soluzione di etanolo al 70%: aggiungere 737 ml di etanolo tecnico al 95% a 263 ml di acqua distillata. Mescolare accuratamente.
   NOTA: Preparare la soluzione di etanolo al 70% su un banco di lavoro non sterile.
   ATTENZIONE: L'etanolo è altamente infiammabile e può causare gravi irritazioni agli occhi. Tenere lontano da fiamme e fonti di calore. In caso di contatto con gli occhi, risciacquare con abbondante acqua.
2. Preparare la soluzione di candeggina al 5%: aggiungere 5 ml di candeggina domestica (contenente ~ 3,5% di ipoclorito di sodio, NaClO) a 95 ml di acqua distillata sterile. Aggiungere ....

Results

Al fine di valutare il tempo necessario per l'intera procedura di sterilizzazione delle sementi, sono state calcolate le differenze di tempo per la manipolazione dei liquidi 96 campioni nel protocollo corrente e confrontate con i metodi di pipettaggio tradizionali. Il risultato indica che il protocollo attuale consente di risparmiare tempo, riducendo il tempo di gestione dei liquidi a un quarto di quello con i protocolli tradizionali (Tabella 1). La tabella evidenzia inoltre che il tempo di rimozione del.......

Discussion

La sterilizzazione dei semi è il passo fondamentale per gli studi funzionali in Arabidopsis. Sebbene sia spesso effettuato per molti scopi diversi, sono disponibili studi limitati sulla sterilizzazione superficiale dei semi ad alto rendimento in Arabidopsis.

Finora, uno dei metodi con il più alto rendimento è l'utilizzo di gas di cloro generato mescolando candeggina con HCl concentrato. Sebbene questo metodo richieda un tempo pratico limitato, utilizza un gas altamente tossico per gli esseri u.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di valvole per acquari	Amazon	B074CYC5SD	composto da 2 valvole e tubi a parete sottile. La valvola impedisce ai liquidi di tornare alla punta sterile
Semi di tipo selvatico Arabidopsis Col-0	Nottingham Stock Center	N1093	Semi di tipo selvatico (sensibili alla kanamicina)
Linea transgenica Arabidopsis Semi di AdoIspS-79	NA	NA	Linea transgenica che sovraesprime un gene dell'isoprene sintasi da Arundo donax trasformato nel background Col-0, resistente alla kanamicina (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583– 2599). Disponibile su richiesta presso gli autori
Microcentrifuga	Eppendorf	EP022628188	Microcentrifuga da banco utilizzata per la centrifuga dei semi
Murashige & Terreno Skoog con vitamine	Duchefa	M0222	Terreno standard per colture sterili di piante
Pipettatore	Marca	26300	Utilizzato per azionare la pipetta sierologica
Tubo in polietilene 1	Roth	9591.1	Tubo per il collegamento dalla pompa del vuoto alla bottiglia di decantazione (diametro interno: 7 mm; diametro esterno: 9 mm)
Tubo in polietilene 2	Roth	9587.1	Tubo per il collegamento dalla bottiglia di decantazione alla valvola dell'acquario (diametro interno: 5 mm; diametro esterno: 7 mm)
Tappo a vite con connettori	Roth	PY86.1	Tappo a vite dosatore a 2 vie GL45 in polipropilene per flacone di decantazione
Pipetta sierologica	Marca	27823	Pipetta sierologica graduata in vetro (riutilizzabile). Le pipette monouso possono essere utilizzate al loro posto
.	Mulino a sfere Qiagen	85300	TissueLyser II utilizzato normalmente per l'omogeneizzazione dei tessuti. Senza l'aggiunta di perline ai tubi funziona come shaker.
Etanolo tecnico	ITW Reagenti (Nova Chimica Srl)	212800	Etanolo 96% v/v parzialmente denaturato grado tecnico
Tween 20	Merck Millipore	655205	Detergente non ionico che funge da tensioattivo
Connettori universali per tubi	Roth	Y523.1	Può essere utilizzato per migliorare/semplificare i collegamenti dei tubi
Pompa per vuoto	Merck Millipore	WP6222050	Utilizzato per Realizzazione del dispositivo di aspirazione