Determinazione della respirazione mitocondriale e della glicolisi in campioni di tessuto retinico Ex Vivo

Sommario

Qui è descritto un protocollo dettagliato per l'esecuzione del test dello stress mitocondriale e del test della velocità glicolitica in campioni di tessuto retinico ex vivo utilizzando un bioanalizzatore commerciale.

Abstract

La respirazione mitocondriale è una via critica che genera energia in tutte le cellule, in particolare i fotorecettori della retina che possiedono un metabolismo altamente attivo. Inoltre, i fotorecettori mostrano anche un'elevata glicolisi aerobica come le cellule tumorali. Misurazioni precise di queste attività metaboliche possono fornire preziose informazioni sull'omeostasi cellulare in condizioni fisiologiche e negli stati patologici. Sono stati sviluppati saggi basati su micropiastre ad alto rendimento per misurare la respirazione mitocondriale e varie attività metaboliche nelle cellule vive. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi sono sviluppati per cellule in coltura e non sono stati ottimizzati per campioni di tessuto intatto e per l'applicazione ex vivo. Qui è descritto un protocollo dettagliato passo-passo, che utilizza la tecnologia di fluorescenza basata su micropiastre, per misurare direttamente il tasso di consumo di ossigeno (OCR) come indicatore della respirazione mitocondriale, nonché il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) come indicatore di glicolisi, nel tessuto retinico ex vivo intatto. Questo metodo è stato utilizzato per valutare con successo le attività metaboliche nella retina del topo adulto e dimostrare la sua applicazione nello studio dei meccanismi cellulari dell'invecchiamento e della malattia.

Introduzione

I mitocondri sono organelli essenziali che regolano il metabolismo cellulare, la segnalazione, l'omeostasi e l'apoptosi coordinando molteplici processi fisiologici ^cruciali1. I mitocondri fungono da centrale elettrica nella cellula per generare adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e fornire energia che supporta quasi tutti gli eventi cellulari. La maggior parte dell'ossigeno cellulare viene metabolizzato nei mitocondri, dove funge da accettore finale di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni (ETC) durante la respirazione aerobica. Basse quantità di ATP possono anche essere prodotte dalla glico....

Protocollo

Tutti i protocolli del topo sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee del National Eye Institute (NEI ASP# 650). I topi sono stati alloggiati in condizioni di luce-buio di 12 ore e curati seguendo le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, l'Istituto delle risorse animali da laboratorio e la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Cartuccia del sensore idratante e preparazione del mezzo di saggio

1. Il giorno prima dell'esperimento, aggiungere 1 mL del mezzo di calibrazione a ciascun pozzetto della piastra di utilità. Posizi....

Risultati

I dati riportati qui sono un test rappresentativo dello stress mitocondriale che mostra tracce OCR (Figura 1) e test della velocità glicolitica che mostra traccia OCR e traccia ECAR (Figura 2), che sono stati eseguiti utilizzando dischi perforati retinici da 1 mm appena sezionati da topi transgenici Nrl-L-EGFP di 4 mesi ⁽ sfondo C57B / L6). Questi topi esprimono GFP specificamente nei fotorecettori a bastoncello senza alterare il.......

Discussione

Di seguito sono fornite istruzioni dettagliate per l'esecuzione di saggi basati su micropiastre della respirazione mitocondriale e dell'attività di glicolisi utilizzando dischi di perforazione retinica ex vivo appena sezionati. Il protocollo è stato ottimizzato per: 1) garantire l'utilizzo di un mezzo di saggio idoneo per il tessuto retinico ex vivo; 2) impiegare dischi di punzonatura retinica di dimensioni adeguate per ottenere letture OCR ed ECAR che rientrano nel campo di rilevamento ottimale della m.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-Deossiglucosio (2-DG), 500 mM di soluzione madre	Sigma	D6134	Sciogliere in cavalluccio marino XF DMEM medium, preparare in anticipo
ago calibro 30	BD Precision Glide	305106
Antimicina A, 10 mM di soluzione madre	Sigma	A8674	Sciogliere in DMSO, preparare in anticipo
Bam15, 10 mM stock soluzione	TimTec	ST056388	Dissolvere in DMSO, preparare in anticipo
Perforatore per biopsia, 1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
Camera
Pinze per dissezione-Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10	con punta dritta
pinze-Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	Microscopio
			dissezione
DMSO	Sigma	D2438
Pinza Graefe	Fine Science Tools	11051-10	a punta curva e seghettata
	Fine Science Tools	15004-08	a punta curva
, 1 M	Sigma-Aldrich	S8263	Soluzione acquosa, preparare in anticipo
Rotenone, 10 mM soluzione madre	Sigma	R8875	Sciogliere in DMSO, preparare in anticipo il mezzo di
calibrazione del cavalluccio marino	Agilent	100840-000
Cavalluccio marino XF 1,0 M glucosio	Agilent	103577-100
Cavalluccio marino XF 100 mM piruvato	Agilent	103578-100
Cavalluccio marino XF 200 mM glutammina	Agilent	103579-100
Cavalluccio marino XF DMEM medio	Agilent	103575-100	pH 7,4, con 5 mM HEPES
Cavalluccio marino XFe24 Cattura isolotti FluxPak	Agilent	103518-100	Contiene cartuccia sensore e micropiastra per cattura isolotti
Cavalluccio marino XFe24, Analizzatore di flusso cellulare extra	Agilent
Soluzione di bicarbonato di sodio, 0,1 M	Sigma-Aldrich	S5761	Soluzione acquosa, preparare in anticipo
Pennello per ciglia superfine	Ted Pella	113

per asfissia di CO2 Dissezione da a punta curva Microforbici Soluzione NaOH