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Articolo metodologico
* These authors contributed equally
La pelle umana decellularizzata è adatta per la rigenerazione dei tessuti. Uno dei principali problemi della decellularizzazione è la conservazione dell'architettura nativa, insieme al contenuto appropriato di proteine strutturali, glicosaminoglicani (GAG) e fattori di crescita. Il metodo proposto consente una decellularizzazione rapida ed efficace, producendo una pelle decellularizzata con caratteristiche native ben conservate.
La matrice extracellulare (ECM) fornisce stimoli biofisici e biochimici per supportare l'auto-rinnovamento, la proliferazione, la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule circostanti grazie al suo contenuto di diverse molecole bioattive. Grazie a queste caratteristiche, la ECM è stata recentemente considerata un candidato promettente per la creazione di scaffold biologici per aumentare la rigenerazione dei tessuti. Studi emergenti hanno dimostrato che i tessuti umani decellularizzati potrebbero assomigliare alla ECM nativa nei loro profili strutturali e biochimici, preservando l'architettura tridimensionale (3D) e il contenuto di molecole biologiche fondamentali. Pertanto, la MEC decellularizzata può essere impiegata per promuovere il rimodellamento, la riparazione e la ricostruzione funzionale dei tessuti di molti organi. La selezione della procedura di decellularizzazione appropriata è fondamentale per ottenere tessuti acellulari che mantengano le caratteristiche del microambiente ideale per le cellule.
Il protocollo qui descritto fornisce una descrizione dettagliata passo dopo passo del metodo di decellularizzazione per ottenere una ECM biologica libera da cellule riproducibile ed efficace. I frammenti di pelle dei pazienti sottoposti a chirurgia plastica sono stati ridimensionati e decellularizzati utilizzando una combinazione di dodecilsolfato di sodio (SDS), Triton X-100 e antibiotici. Per favorire il trasporto regolare e omogeneo della soluzione attraverso i campioni, questi sono stati racchiusi in cassette di inclusione per garantire la protezione dagli insulti meccanici. Dopo la procedura di decellularizzazione, il colore bianco come la neve dei frammenti di pelle indicava una decellularizzazione completa e riuscita. Inoltre, i campioni decellularizzati hanno mostrato un'architettura intatta e ben conservata. I risultati suggeriscono che il metodo di decellularizzazione proposto era efficace, veloce e riproducibile e proteggeva i campioni dai danni architettonici.
La MEC funge da impalcatura per le cellule, sostenendole attraverso un'intricata architettura mantenuta da diversi componenti, ed è uno dei principali fattori responsabili delle proprietà meccaniche del cuore e della funzione del tessuto cardiaco 1,2. Prove crescenti suggeriscono che la MEC svolge un ruolo attivo nel rimodellamento dei tessuti, rendendo obsoleta l'ipotesi convenzionale che la MEC sia un componente passivo 3,4,5,6. Il ruolo della MEC ....
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I campioni di tessuto umano sono stati raccolti secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e osservando le linee guida dell'Ospedale Universitario "Federico II". Tutti i pazienti coinvolti in questo studio hanno fornito moduli di consenso scritti.
1. Preparazione delle soluzioni
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Lo scopo del protocollo era quello di ottenere un campione di d-ECM cutanea da tessuto biologico, mantenendo una struttura 3D ben organizzata e un contenuto di molecole biologiche ben conservato (Figura 1). Questo metodo si basa principalmente sull'agitazione costante dei campioni in una soluzione contenente la combinazione di due detergenti, Triton X-100 e SDS, preservando così le caratteristiche biologiche e strutturali tipiche del tessuto nativo e riducen.......
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Sebbene il protocollo sopra descritto sia stato ottimizzato e migliorato rispetto ai protocolli pubblicati in precedenza, presenta alcuni passaggi critici che richiedono attenzione e precisione. La formazione di schiuma deve essere evitata durante la preparazione della soluzione decellularizzante per evitare un'errata diluizione dei detergenti. Questo problema potrebbe essere risolto versando delicatamente le soluzioni e facendole scorrere lungo il lato interno del cilindro. Inoltre, è n.......
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,9% NaCl isotonico Soluzione fisiologica | Sigma-Aldrich | S8776 | 0,9% in acqua |
| Becher da 1 L | VWR | 511-0318 | Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso |
| Pipetta sierologica da 10 mL | Falcon | 357551 | Piastre sterili, in polistirene |
| 100 mm | Falcon | 351029 | Piastra per colture cellulari sterili trattate |
| Provette sterili da 15 mL | Falcon | 352097 | Provette sterili per centrifuga, polipropilene |
| 1 L cilindro graduato | VWR | 612-1524 | Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso |
| Flacone da 2 L | VWR | 215-1596 | Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso |
| Pipetta sierologica da 25 mL | Falcon | 357525 | Sterile, polistirene |
| Cilindro graduato | VWR | 612-3072 | Pulire e autoclave prima dell'uso |
| becher da 500 mL | VWR | 511-0317 | Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso |
| Amfotericina B | Sigma-Aldrich | Y0000005 | Tavola |
| da dissezione | VWR | 100498-398 | Realizzato in polietilene ad alta densità. |
| Bisturi da dissezione | VWR | 233-5526 | Cassette per inclusione sterili e monouso |
| Diapath | 070191 | Dimensioni esterne: 40x26x7 mm (LxPxA) | |
| Pinze fini | VWR | 232-1317 | Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso |
| Imbuto | VWR | 221-1861 | Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso |
| Barche di pesatura esagonali taglia M | Sigma-Aldrich | Z708585 | Esagonale, polistirolo, 51 mm D.I. inferiore, 64 mm D.I. |
| Barche di pesatura esagonali taglia S | Sigma-Aldrich | Z708577 | Esagonale, polistirolo, 25 mm Diametro interno inferiore, 38 mm Diametro interno superiore |
| Forbici chirurgiche grandi | VWR | 233-1211 | Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso |
| Pinza lunga | VWR | 232-0096 | Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso |
| Penicillina e streptomicina | Sigma-Aldrich | P4333-100ml | Stabilizzato, con 10.000 unità di penicillina e 10 mg di streptomicina/mL, 0,1 μ m filtrato. Negozio a -20 gradi C. La soluzione deve essere aliquotato in volumi di lavoro più piccoli per evitare ripetuti cicli di congelamento/disgelo Soluzione. |
| Pistola pipetta | Eppendorf | 613-2795 | Eppendorf Easypet® 3 |
| Vassoio in plastica | VWR | BELAH162620000 | Vassoio in plastica polipropilene resistente alla corrosione |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | P9333 | in polvere |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma-Aldrich | P5665 | |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | Polvere |
| di sodio dodecil solfato | Sigma-Aldrich | 62862 | Polvere |
| di fosfato di sodio bibasico | Sigma-Aldrich | 94046 | Spatola in polvere |
| VWR | RSGA038.210 | Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso | |
| Cucchiaio | VWR | 231-1314 | Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso |
| Barra di agitazione | VWR | 442-0362 | Pulire e autoclave prima dell'uso |
| Ancoretta recuperatrice | VWR | 89026-262 | Stampato in PTFE puro, approvato dalla FDA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Liquido |
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