Decellularizzazione per la preparazione di matrici cutanee acellulari umane altamente conservate per la medicina rigenerativa

Sommario

La pelle umana decellularizzata è adatta per la rigenerazione dei tessuti. Uno dei principali problemi della decellularizzazione è la conservazione dell'architettura nativa, insieme al contenuto appropriato di proteine strutturali, glicosaminoglicani (GAG) e fattori di crescita. Il metodo proposto consente una decellularizzazione rapida ed efficace, producendo una pelle decellularizzata con caratteristiche native ben conservate.

Abstract

La matrice extracellulare (ECM) fornisce stimoli biofisici e biochimici per supportare l'auto-rinnovamento, la proliferazione, la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule circostanti grazie al suo contenuto di diverse molecole bioattive. Grazie a queste caratteristiche, la ECM è stata recentemente considerata un candidato promettente per la creazione di scaffold biologici per aumentare la rigenerazione dei tessuti. Studi emergenti hanno dimostrato che i tessuti umani decellularizzati potrebbero assomigliare alla ECM nativa nei loro profili strutturali e biochimici, preservando l'architettura tridimensionale (3D) e il contenuto di molecole biologiche fondamentali. Pertanto, la MEC decellularizzata può essere impiegata per promuovere il rimodellamento, la riparazione e la ricostruzione funzionale dei tessuti di molti organi. La selezione della procedura di decellularizzazione appropriata è fondamentale per ottenere tessuti acellulari che mantengano le caratteristiche del microambiente ideale per le cellule.

Il protocollo qui descritto fornisce una descrizione dettagliata passo dopo passo del metodo di decellularizzazione per ottenere una ECM biologica libera da cellule riproducibile ed efficace. I frammenti di pelle dei pazienti sottoposti a chirurgia plastica sono stati ridimensionati e decellularizzati utilizzando una combinazione di dodecilsolfato di sodio (SDS), Triton X-100 e antibiotici. Per favorire il trasporto regolare e omogeneo della soluzione attraverso i campioni, questi sono stati racchiusi in cassette di inclusione per garantire la protezione dagli insulti meccanici. Dopo la procedura di decellularizzazione, il colore bianco come la neve dei frammenti di pelle indicava una decellularizzazione completa e riuscita. Inoltre, i campioni decellularizzati hanno mostrato un'architettura intatta e ben conservata. I risultati suggeriscono che il metodo di decellularizzazione proposto era efficace, veloce e riproducibile e proteggeva i campioni dai danni architettonici.

Introduzione

La MEC funge da impalcatura per le cellule, sostenendole attraverso un'intricata architettura mantenuta da diversi componenti, ed è uno dei principali fattori responsabili delle proprietà meccaniche del cuore e della funzione del tessuto cardiaco ^1,2. Prove crescenti suggeriscono che la MEC svolge un ruolo attivo nel rimodellamento dei tessuti, rendendo obsoleta l'ipotesi convenzionale che la MEC sia un componente passivo 3,4,5,6. Il ruolo della MEC è quello di fornire segnali biofisici e biochimici alle cellule residenti. È ben noto che questi segnali possono influenzare molti comportamenti cellulari fondamentali, influenzando la loro funzione contrattile, la proliferazione, la migrazione e il potenziale di differenziazione ^7,8,9. Pertanto, l'ECM viene sempre più impiegata nell'ingegneria tissutale e nella medicina rigenerativa come strumento di supporto terapeutico 9,10,11,12,13.

La MEC è costituita da diverse proteine come il collagene, l'elastina, la fibronectina, il proteoglicano e la laminina, insieme a fattori di crescita legati alla MEC, tutti coinvolti nei meccanismi di rigenerazione, come il reclutamento, la migrazione e la differenziazione cellulare, nonché l'allineamento e la proliferazione cellulare¹⁴. Le proprietà meccaniche dei tessuti hanno grande rilevanza anche nella fisiopatologia degli organi. Infatti, i cambiamenti nelle proprietà meccaniche sono spesso associati all'insorgenza e all'evoluzione di diverse malattie. La ragione risiede nel fatto che quando la ECM viene modificata, i segnali provenienti dall'ambiente inducono cambiamenti nell'espressione genica e proteica, portando a una compromissione funzionale^15,16.

Le terapie rigenerative per la riparazione degli organi sono attualmente focalizzate sulla replicazione del sofisticato microambiente del tessuto nativo per guarire l'organo in cui il corpo fallisce. Nonostante il ritmo rapido di molti approcci di ingegneria tissutale, i tessuti non possono ancora essere riprodotti accuratamente nella loro interezza e complessità mediante procedure artificiali. I materiali sintetici sono stati ampiamente impiegati finora, in quanto possono essere opportunamente regolati per simulare le proprietà meccaniche e biochimiche del microambiente cellulare. Tuttavia, hanno dei limiti, come l'incapacità di imitare le numerose interazioni all'interno del tessuto nativo, il costo delle tecnologie per produrli e il fatto che sono meno naturali e biocompatibili del tessuto nativo 17,18,19. Inoltre, la loro composizione, principalmente in termini di proteine e fattori solubili, differisce notevolmente da quella naturale, che è estremamente difficile da replicare²⁰.

L'approccio all'avanguardia nella medicina rigenerativa per ridurre il divario tra i pazienti bisognosi e i trapianti d'organo consiste nel produrre scaffold costituiti da matrice extracellulare decellularizzata (d-ECM) e ripopolarli con i tipi di cellule appropriati per rigenerare gli organi danneggiati. La decellularizzazione è il processo in cui la MEC viene isolata dalle sue cellule native e dal materiale genetico per produrre uno scaffold naturale e biomimetico, in grado di evitare la risposta immunitaria e il rigetto una volta impiantata nei pazienti 21,22,23. La MEC così ottenuta può quindi essere ripopolata per produrre tessuto funzionale. Il problema principale quando si sviluppa una d-ECM è il metodo. Per qualsiasi tecnica di decellularizzazione, l'obiettivo principale rimane la conservazione della composizione, della rigidità e della struttura 3D della ECM nativa, e tutte le strategie hanno sia vantaggi che svantaggi. Poiché l'eliminazione del contenuto cellulare e del DNA dal tessuto richiede l'uso di agenti chimici o fisici, o la combinazione di entrambi, ogni procedura di decellularizzazione causa, in misura diversa, la rottura della MEC. Pertanto, è fondamentale ridurre al minimo i danni all'ECM 24,25,26.

L'utilizzo della ECM nativa come piattaforma per la ricostituzione della ECM nativa in vitro è altamente auspicabile. A questo scopo, diversi protocolli di decellularizzazione sono stati applicati a un'ampia gamma di tessuti 27,28,29,30. Infatti, sin dalle prime fasi della ricerca sulla decellularizzazione e dello sviluppo della ECM, diversi tessuti, come arterie, valvole aortiche e nervi periferici sia di animali che di esseri umani, sono stati decellularizzati e alcune d-ECM sono ancora disponibili in commercio e utilizzate per la sostituzione dei tessuti o la guarigione delle ferite 31,32,33. Recentemente, la pelle umana è emersa anche come un candidato adatto per produrre scaffold decellularizzati per la riparazione cardiaca grazie alla sua composizione e alle proprietà meccaniche, in grado di aumentare il potenziale rigenerativo delle cellule progenitrici cardiache (CPC) e adattarsi alla contrattilità cardiaca³⁴. Questo articolo descrive un protocollo semplice e veloce per produrre scaffold decellularizzati da pelle umana adulta, consentendo lo sviluppo di una d-ECM con architettura ben conservata.

Protocollo

I campioni di tessuto umano sono stati raccolti secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e osservando le linee guida dell'Ospedale Universitario "Federico II". Tutti i pazienti coinvolti in questo studio hanno fornito moduli di consenso scritti.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparazione di 1200 mL di soluzione decellularizzante all'1%
   1. Preparare 600 mL di soluzione Triton X-100 al 2% misurando 588 mL di acqua bidistillata in un cilindro graduato e trasferendolo in un becher da 1 L. Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 12 mL di Triton X-100 e un'ancoretta di cottura al becher. Posizionare il becher su un agitatore magnetico e mescolare la soluzione fino a quando il Triton X-100 non è completamente sciolto.
   2. Ferma l'agitazione. Rimuovere l'ancoretta utilizzando un ancometro retriever. Conservare a temperatura ambiente.
   3. Preparare 600 mL di soluzione SDS al 2% misurando 550 mL di acqua bidistillata in un cilindro graduato e trasferendolo in un becher da 1 L.
   4. Pesare 12 g di polvere SDS in una bocchetta di plastica per pesare e trasferirla nel becher contenente l'acqua bidistillata al punto 1.1.3.
      NOTA: Il passaggio 1.1.4 deve essere eseguito sotto una cappa chimica e l'utente deve indossare dispositivi di protezione individuale.
   5. Aggiungere un'ancoretta di combustione, posizionare il becher su un agitatore magnetico e mescolare la soluzione fino a quando la SDS non è completamente sciolta.
   6. Arrestare il processo di agitazione. Rimuovere l'ancoretta utilizzando un ancometro retriever.
   7. Trasferire la soluzione in un cilindro graduato e regolare il volume a 600 mL aggiungendo acqua bidistillata.
   8. Versare la soluzione Triton X-100 al 2% preparata al punto 1.1.1 in un cilindro da 2 L.
   9. Versare la soluzione SDS al 2% preparata nei passaggi 1.1.3-1.1.7 nello stesso cilindro da 2 L per ottenere un volume totale di 1200 mL.
   10. Coprire con parafilm e mescolare delicatamente per inversione fino ad ottenere una soluzione omogenea.
   11. Trasferire la soluzione miscelata in una bottiglia da 2 L utilizzando un imbuto per evitare la formazione di schiuma. Conservare la soluzione a +4 °C.
2. Preparazione di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
   1. Preparare 500 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sciogliendo 0,1 g di fosfato di potassio monobasico, 0,1 g di cloruro di potassio, 4,0 g di cloruro di sodio e 0,575 g di fosfato di sodio bibasico in acqua sterile a doppia distillazione. Controllare il valore del pH (7.4).
   2. Conservare a +4 °C fino al momento dell'uso.
3. Preparazione della soluzione antibiotica
   1. Pesare 625 μg di amfotericina B in una navicella di plastica.
   2. Pipettare 8 mL di una miscela di penicillina e streptomicina (penna/streptococco) in una provetta da 15 mL.
   3. Aggiungere l'amfotericina B pesata alla miscela penna/streptococco e regolare il volume a 10 ml aggiungendo la miscela di penicillina e streptomicina (penna/streptococco). Tappare la provetta e sciogliere l'amfotericina B agitando energicamente.

2. Giorno 1 - iniziare la procedura di decellularizzazione.

1. Versare 400 mL della soluzione decellularizzante in un becher da 500 mL.
2. Aggiungere 2,0 ml di soluzione antibiotica.

3. Preparazione di campioni di pelle

1. Lavare il campione di pelle umana dall'addome dei pazienti sottoposti ad addominoplastica in un vassoio di plastica fissandolo e capovolgendolo in una soluzione fisiologica isotonica di NaCl allo 0,9% per rimuovere il sangue in eccesso e altri fluidi biologici.
2. Rimuovi i peli usando una pinza fine e il grasso usando grandi forbici chirurgiche.
3. Posizionare il campione di pelle sulla tavola da dissezione e sezionarlo con un bisturi, con le graduazioni sulla tavola da dissezione come riferimento per ottenere frammenti di 3 cm x 2,5 cm (lunghezza per larghezza), evitando cicatrici e zone sporche o bruciate del tessuto.
4. Posizionare ogni frammento in una cassetta di inclusione, chiuderla e assicurarsi che tutte le cassette siano bloccate in modo appropriato per evitare perdite di campione durante la procedura di decellularizzazione.
5. Posizionare un massimo di quattro cassette di inclusione con i campioni in un becher con la soluzione decellularizzante. Aggiungi una barra di agitazione. Coprire con un foglio di alluminio, scrivendo sulla parte superiore tutte le informazioni per identificare il campione e l'ora di inizio della procedura.
6. Posizionare il becher sull'agitatore magnetico e avviare l'agitazione a una velocità di rotazione di 150 giri/min. Ferma l'agitazione. Rimuovere il foglio di alluminio che copre il becher ed estrarre le cassette di inclusione con una pinza lunga.
   NOTA: Dopo aver interrotto l'agitazione, controllare la limpidezza della soluzione. Modificare la durata dell'agitazione (inferiore o superiore alle 8 ore) in base al grado di intorbidamento dovuto al rilascio di detriti cellulari.
7. Mettere ogni cassetta in una pirofila da 100 mm. Sostituire la soluzione decellularizzante ripetendo i passaggi 3.5-3.6 durante la notte.

4. Giorno 2 - controllare lo stato dei campioni di pelle.

1. Arrestare il processo di agitazione. Rimuovere il foglio di alluminio che copre il becher ed estrarre le cassette di inclusione con una pinza lunga.
2. Mettere ogni cassetta in un piatto da 100 mm e aprirlo. Controllare il colore del campione.
   NOTA: I campioni potrebbero mostrare un cambiamento di colore dal beige nativo al bianco come la neve.
3. Rimuovere i peli residui e staccare l'epidermide dal derma. Sostituire la soluzione decellularizzante ripetendo i passaggi 3.5-3.6.
4. Interrompere l'agitazione dopo 8 ore. Ripetere i passaggi 4.1-4.2 fino a quando il campione appare bianco come la neve. Interrompere la procedura di decellularizzazione.
   NOTA: Il tempo di esposizione all'azione dei detergenti può essere prolungato se necessario.
5. Misurare 400 mL di 1x PBS in un cilindro da 500 mL, versarlo in un becher da 500 mL e aggiungere 2 mL della miscela Pen Strep/Amfotericina B. Aggiungi una barra di agitazione.
6. Posizionare un massimo di quattro cassette contenenti i campioni in ciascun becher con 1x soluzione di PBS/antibiotici. Coprite con un foglio di alluminio e scrivete tutte le informazioni sulla parte superiore come al punto 3.5.
7. Posizionare il becher su un agitatore magnetico e avviare l'agitazione a una velocità di rotazione di 150 giri/min durante la notte, a temperatura ambiente.

5. Giorno 3 - un lavaggio finale dei campioni

1. Ferma l'agitazione. Sostituire la soluzione 1x PBS con 400 ml di acqua bidistillata. Aggiungi una barra di agitazione. Coprite con un foglio di alluminio e scrivete sopra tutte le informazioni come al punto 3.5.
2. Posizionare il becher su un agitatore magnetico e avviare l'agitazione a una velocità di rotazione di 150 giri/min per 30 minuti.
3. Arrestare il processo di agitazione. Rimuovere il foglio di alluminio che copre il becher ed estrarre le cassette di inclusione con una pinza lunga.
4. Collocare ogni cassetta di inclusione contenente il campione di pelle decellularizzata in un piatto da 100 mm. Aprire le cassette e asciugare delicatamente i campioni di pelle tamponandoli con salviette da laboratorio.
5. Collocare ogni campione di pelle decellularizzata in una barca di pesata precedentemente etichettata con le informazioni sul campione. Copri la barca con un foglio di alluminio e scrivi tutte le informazioni sulla parte superiore per identificare il campione. Conservare a - 80 °C.

Risultati

Lo scopo del protocollo era quello di ottenere un campione di d-ECM cutanea da tessuto biologico, mantenendo una struttura 3D ben organizzata e un contenuto di molecole biologiche ben conservato (Figura 1). Questo metodo si basa principalmente sull'agitazione costante dei campioni in una soluzione contenente la combinazione di due detergenti, Triton X-100 e SDS, preservando così le caratteristiche biologiche e strutturali tipiche del tessuto nativo e riducendo il tempo di esposizione durante...

Discussione

Sebbene il protocollo sopra descritto sia stato ottimizzato e migliorato rispetto ai protocolli pubblicati in precedenza, presenta alcuni passaggi critici che richiedono attenzione e precisione. La formazione di schiuma deve essere evitata durante la preparazione della soluzione decellularizzante per evitare un'errata diluizione dei detergenti. Questo problema potrebbe essere risolto versando delicatamente le soluzioni e facendole scorrere lungo il lato interno del cilindro. Inoltre, è n...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,9% NaCl isotonico Soluzione fisiologica	Sigma-Aldrich	S8776	0,9% in acqua
Becher da 1 L	VWR	511-0318	Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Pipetta sierologica da 10 mL	Falcon	357551	Piastre sterili, in polistirene
100 mm	Falcon	351029	Piastra per colture cellulari sterili trattate
Provette sterili da 15 mL	Falcon	352097	Provette sterili per centrifuga, polipropilene
1 L cilindro graduato	VWR	612-1524	Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Flacone da 2 L	VWR	215-1596	Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Pipetta sierologica da 25 mL	Falcon	357525	Sterile,  polistirene
Cilindro graduato	VWR	612-3072	Pulire e autoclave prima dell'uso
becher da 500 mL	VWR	511-0317	Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Amfotericina B	Sigma-Aldrich	Y0000005	Tavola
da dissezione	VWR	100498-398	Realizzato in polietilene ad alta densità.
Bisturi da dissezione	VWR	233-5526	Cassette per inclusione sterili e monouso
	Diapath	070191	Dimensioni esterne: 40x26x7 mm (LxPxA)
Pinze fini	VWR	232-1317	Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Imbuto	VWR	221-1861	Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Barche di pesatura esagonali taglia M	Sigma-Aldrich	Z708585	Esagonale, polistirolo, 51 mm D.I. inferiore, 64 mm D.I.
Barche di pesatura esagonali taglia S	Sigma-Aldrich	Z708577	Esagonale, polistirolo, 25 mm Diametro interno inferiore, 38 mm Diametro interno superiore
Forbici chirurgiche grandi	VWR	233-1211	Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Pinza lunga	VWR	232-0096	Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Penicillina e streptomicina	Sigma-Aldrich	P4333-100ml	Stabilizzato, con 10.000 unità di penicillina e 10 mg di streptomicina/mL, 0,1 μ m filtrato. Negozio a -20 gradi C. La soluzione  deve essere aliquotato in volumi di lavoro più piccoli per evitare ripetuti cicli di congelamento/disgelo Soluzione.
Pistola pipetta	Eppendorf	613-2795	Eppendorf Easypet® 3
Vassoio in plastica	VWR	BELAH162620000	Vassoio in plastica polipropilene resistente alla corrosione
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P9333	in polvere
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	P5665
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7653	Polvere
di sodio dodecil solfato	Sigma-Aldrich	62862	Polvere
di fosfato di sodio bibasico	Sigma-Aldrich	94046	Spatola in polvere
	VWR	RSGA038.210	Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Cucchiaio	VWR	231-1314	Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Barra di agitazione	VWR	442-0362	Pulire e autoclave prima dell'uso
Ancoretta recuperatrice	VWR	89026-262	Stampato in PTFE puro, approvato dalla FDA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Liquido