L'ibridazione multiplex in situ (ISH) è stata impiegata per visualizzare simultaneamente i trascritti per due recettori accoppiati a proteine G e un fattore di trascrizione nell'intero complesso gangliare vagale del topo adulto. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per generare mappe accurate dei profili trascrizionali dei neuroni afferenti vagali.
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Articolo metodologico
Rilevazione dell'espressione del recettore accoppiato alla proteina G nei neuroni afferenti vagali di topo utilizzando l'ibridazione multiplex in situ
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo studio descrive un protocollo per l'ibridazione multiplex in situ (ISH) dei gangli giugulare-nodosi del topo, con particolare attenzione alla rilevazione dell'espressione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR). I gangli giugulare-nodosi fissati in formalina sono stati elaborati con la tecnologia RNAscope per rilevare contemporaneamente l'espressione di due GPCR rappresentativi (colecistochinina e recettori della grelina) in combinazione con un gene marcatore di nodosi (omeobox 2b accoppiato, Phox2b) o neuroni afferenti giugulari (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). I gangli etichettati sono stati ripresi utilizzando la microscopia confocale per determinare i modelli di distribuzione ed espressione dei suddetti trascritti. In breve, i neuroni afferenti Phox2b sono stati trovati per esprimere abbondantemente il recettore colecistochinina (Cck1r) ma non il recettore della grelina (Ghsr). È stato anche scoperto che un piccolo sottoinsieme di neuroni afferenti Prdm12 esprime Ghsr e / o Cck1r. Vengono discussi potenziali avvertimenti tecnici nella progettazione, nell'elaborazione e nell'interpretazione dell'ISH multiplex. L'approccio descritto in questo articolo può aiutare gli scienziati a generare mappe accurate dei profili trascrizionali dei neuroni afferenti vagali.
Introduzione
I corpi cellulari delle afferenze vagali sono contenuti nei gangli giugulari, petrosali e nodosi1,2,3. I loro assoni viaggiano insieme attraverso diversi rami del nervo vago ai territori craniocervicale, toracico e addominale4,5,6,7. Dalle loro terminazioni viscerali, le afferenze vagali possono rispondere a una vasta gamma di stimoli fisiologici e nocivi8,9,
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Protocollo
NOTA: I topi utilizzati in questo studio erano maschi selvatici su uno sfondo C57BL / 6J puro. Un totale di 4 topi sono stati utilizzati per multiplex ISH. Tutti i topi avevano circa 8 settimane al momento del sacrificio. Un topo maschio (di circa un anno) è stato anche usato per dimostrare la fluorescenza endogena associata all'invecchiamento. Gli animali sono stati alloggiati in gabbie ventilate all'interno di una struttura di barriera con accesso ad libitum a cibo e acqua. L'UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee ha esaminato e approvato le procedure descritte di seguito. I dettagli sui reagenti e gli strumenti sono disp....
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Risultati
Mentre RNAScope può essere applicato ad animali di qualsiasi età, sesso o background genetico, è consigliabile lavorare con giovani adulti (<3 mesi). Questo perché gli artefatti fluorescenti (ad esempio, lipofuscina) sono risultati comuni nei neuroni di animali più anziani41. I gangli fissati in formalina dei topi più anziani contengono spesso una fluorescenza endogena sorprendentemente intensa che può essere facilmente scambiata per una colorazione genuina (Figura 1A
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Discussione
La tecnica di ISH è stata inventata alla fine del 196042. Tuttavia, non è fino alla metà degli anni 1980 che è stato applicato per il rilevamento di mRNA nel sistema nervoso centrale e periferico43,44. Considerando l'eterogeneità del sistema nervoso e i problemi ricorrenti con gli anticorpi, localizzare un particolare trascritto a livello cellulare rimane uno strumento inestimabile. Tuttavia, i metodi ISH tradizionali sono rimasti laborios.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core finanziato dalla sovvenzione NIH #5P01DK119130-02. Gli autori desiderano riconoscere l'assistenza della UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (guidata dal Dr. Phelps) e del suo staff (Abhijit Bugde e Marcel Mettlen), supportati in parte dal NIH Grant #1S10OD021684-01, una risorsa condivisa dell'Harold C. Simmons Cancer Center, supportata in parte da una sovvenzione di supporto ncI Cancer Center, P30 CA142543.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763-80 | |
| ° C congelatore | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | software fotografico e di progettazione | |
| Forno di cottura | Thermo Scientific | Modello: 658 | |
| Microscopio confocale | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Vetro di copertura | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Pinze | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mezzo di montaggio |
| HybEZ forno | di ibridazione | ||
| Penna idrofobica | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Forbici grandi | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro provette per centrifuga | VWR | 20170-333 | |
| Minipompa a flusso variabile | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Biomarcatore fluorescente |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Biomarcatore fluorescente |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Biomarcatore fluorescente |
| ProLong Gold Mezzo | per cellule marcate in fluorescenza | ||
| Kit di reagenti fluorescenti RNAscope Multiplex v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | Kit multiplex |
| Sonda RNAscope Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| Sonda RNAscope Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| Sonda RNAscope Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | ||
| Sonda RNAscope Topo Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| Sonda RNAscope Topo Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase soluzione decontaminante |
| Piccole forbici da dissezione | Millipore Sigma | Z265977 | |
| vetrini | Superfrost PlusFisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| Manuale utente | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Forbici a molla | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Software di imaging | Zeiss |
Riferimenti
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets withi....
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Ristampe e permessi
