È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Rilevazione dell'espressione del recettore accoppiato alla proteina G nei neuroni afferenti vagali di topo utilizzando l'ibridazione multiplex in situ

3.8K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/62945

⸱

20 settembre 2021

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

In questo articolo

Sommario

L'ibridazione multiplex in situ (ISH) è stata impiegata per visualizzare simultaneamente i trascritti per due recettori accoppiati a proteine G e un fattore di trascrizione nell'intero complesso gangliare vagale del topo adulto. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per generare mappe accurate dei profili trascrizionali dei neuroni afferenti vagali.

Abstract

Questo studio descrive un protocollo per l'ibridazione multiplex in situ (ISH) dei gangli giugulare-nodosi del topo, con particolare attenzione alla rilevazione dell'espressione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR). I gangli giugulare-nodosi fissati in formalina sono stati elaborati con la tecnologia RNAscope per rilevare contemporaneamente l'espressione di due GPCR rappresentativi (colecistochinina e recettori della grelina) in combinazione con un gene marcatore di nodosi (omeobox 2b accoppiato, Phox2b) o neuroni afferenti giugulari (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). I gangli etichettati sono stati ripresi utilizzando la microscopia confocale per determinare i modelli di distribuzione ed espressione dei suddetti trascritti. In breve, i neuroni afferenti Phox2b sono stati trovati per esprimere abbondantemente il recettore colecistochinina (Cck1r) ma non il recettore della grelina (Ghsr). È stato anche scoperto che un piccolo sottoinsieme di neuroni afferenti Prdm12 esprime Ghsr e / o Cck1r. Vengono discussi potenziali avvertimenti tecnici nella progettazione, nell'elaborazione e nell'interpretazione dell'ISH multiplex. L'approccio descritto in questo articolo può aiutare gli scienziati a generare mappe accurate dei profili trascrizionali dei neuroni afferenti vagali.

Introduzione

I corpi cellulari delle afferenze vagali sono contenuti nei gangli giugulari, petrosali e nodosi1,2,3. I loro assoni viaggiano insieme attraverso diversi rami del nervo vago ai territori craniocervicale, toracico e addominale4,5,6,7. Dalle loro terminazioni viscerali, le afferenze vagali possono rispondere a una vasta gamma di stimoli fisiologici e nocivi8,9,10. Tuttavia, la distribuzione delle molecole di segnalazione e dei recettori coinvolti nel rilevamento vagale rimane scarsamente caratterizzata. Ciò è in parte dovuto al fatto che i gangli vagali, nonostante le loro piccole dimensioni, esprimono un ampio spettro di recettori, tra cui un gran numero di GPCR8,11,12,13. Inoltre, i neuroni afferenti vagali sono intrinsecamente eterogenei e mostrano profili molecolari distinti14. A complicare la questione, i gangli giugulari, petrosali e nodosi sono attaccati al topo, formando così una singola massa gangliare. Infine, in un sottogruppo di animali, il ganglio nodoso è attaccato al ganglio cervicale superiore simpatico15.

In passato, i ricercatori si sono rivolti all'immunoistochimica per studiare la composizione neurochimica dei neuroni afferenti vagali16,17,18. Mentre l'immunoistochimica che utilizza anticorpi convalidati è utile, i risultati degli studi immunoistochimici devono essere interpretati con cautela. Ad esempio, numerosi sforzi per identificare anticorpi specifici contro i GPCR hanno fallito19,20,21,22,23,24,25,portando gli investigatori a concludere che la maggior parte degli anticorpi contro i GPCR sono inaffidabili. Per aggirare questi problemi, la PCR quantitativa (qPCR) è stata ampiamente utilizzata per valutare l'espressione genica nel roditore vagale di massa gangliare26,27,28,29. Tuttavia, l'esame dell'espressione genica utilizzando la qPCR avviene al costo di una perdita di informazioni spaziali. In particolare, non è possibile prevedere quante cellule o quali tipi di cellule esprimono un particolare gene di interesse (ad esempio, nodosi vs cellule giugulari). I problemi ricorrenti includono anche la contaminazione con i tessuti adiacenti e l'inclusione di lunghezze variabili del nervo vago, gangli cervicali e giugulari superiori durante la dissezione15. Come risultato delle difficoltà di cui sopra, la controversia circonda l'espressione e la distribuzione di diversi GPCR nei neuroni afferenti vagali. Un esempio particolarmente sconcertante riguarda il recettore della grelina (Ghsr). Mentre alcuni studi hanno trovato un'espressione diffusa di questo recettore nei neuroni afferenti vagali30,31,32,altri hanno trovato l'mRNA di Ghsr quasi non rilevabile nel ganglio nodoso11,14. È quindi necessaria una mappatura dettagliata dell'mRNA di Ghsr nella massa gangliare vagale.

L'ibridazione in situ (ISH) è stata utilizzata anche per valutare i modelli di espressione genica nella massa gangliare vagale7,11, 12,33,34,35. Poiché le tecniche basate sull'RNA rimangono più affidabili e specifiche rispetto alle tecniche basate sugli anticorpi nella maggior parte delle circostanze36,37,gli studi ISH si sono dimostrati preziosi per una migliore comprensione della codifica neurochimica dei neuroni afferenti vagali. Tuttavia, le stesse tecniche ISH tradizionali non sono prive di avvertimenti. L'ISH radioattivo è sensibile ma genera sfondo e rimane ingombrante38. L'ISH non radioattivo è meno complicato ma anche meno sensibile38. Al contrario, il metodo RNAscope ISH recentemente sviluppato è altamente sensibile e genera uno sfondo minimo39. L'attuale studio ha applicato l'RNAscopio fluorescente multiplex al rilevamento di GPCR nei neuroni afferenti vagali del topo. Ci siamo concentrati sulla mappatura della distribuzione di Ghsr e abbiamo confrontato la sua distribuzione con quella del recettore colecistochinina (Cck1r), un altro GPCR ben noto per essere espresso nel ganglio nodoso34. Infine, i due fattori di trascrizione, l'omeobox 2b accoppiato (Phox2b) e la proteina 12 del dito di zinco del dominio PR (Prdm12), sono stati utilizzati come marcatori selettivi per i neuroni afferenti nodosi e giugulari, rispettivamente14. Senza visualizzare Phox2b o Prdm12, sarebbe difficile identificare con certezza le afferenze giugulari vs nodosi. Potenziali insidie tecniche sono anche discusse in tutto l'articolo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

NOTA: I topi utilizzati in questo studio erano maschi selvatici su uno sfondo C57BL / 6J puro. Un totale di 4 topi sono stati utilizzati per multiplex ISH. Tutti i topi avevano circa 8 settimane al momento del sacrificio. Un topo maschio (di circa un anno) è stato anche usato per dimostrare la fluorescenza endogena associata all'invecchiamento. Gli animali sono stati alloggiati in gabbie ventilate all'interno di una struttura di barriera con accesso ad libitum a cibo e acqua. L'UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee ha esaminato e approvato le procedure descritte di seguito. I dettagli sui reagenti e gli strumenti sono disponibili nella Tabella dei materiali.

1. Raccolta dei campioni

  1. Il giorno del sacrificio, somministrare un sovradosaggio di idrato di cloralio (500 mg / kg, i.p.) ai topi. Perfondere i topi profondamente anestetizzati transcardialmente utilizzando una pompa peristaltica con 5 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) seguita da 50 ml di formalina al 10% a temperatura ambiente.
    NOTA: Questo viene fatto in una cappa aspirante per prevenire l'inalazione di formalina.
  2. Poiché i gangli nodosi, petrosali e giugulari sono fusi per formare un'unica massa gangliare nel topo15, raccogliere con cura l'intera massa ganglionica vagale da ciascun lato (sinistra e destra) con l'aiuto di un cannocchiale sezionante e forbici e pinze a molla fine (vedi la Tabella dei materiali).
  3. Quando si decapita il topo con un paio di grandi forbici (vedi la Tabella dei materiali),evitare di schiacciare il tronco cerebrale.
  4. Seguendo un approccio di dissezione descritto in precedenza nel ratto40,rimuovere i muscoli sternoioidi e omoioidi laterali alla trachea con piccole pinze(Tabella dei materiali)per esporre l'osso occipitale. Liberare l'intera regione di muscolo, tessuto adiposo e tessuto congiuntivo fino a quando l'arteria carotide, il nervo vago, il nervo ipoglosso e il forame magno sono visibili. Tagliare l'intero nervo ipoglosso con piccole forbici a molla (Tabella dei materiali).
  5. Cerca il ganglio nodoso come massa traslucida vicino al forame magnum15. Usando piccole forbici(Tabella dei materiali),rompere con cura l'osso occipitale per esporre ulteriormente il ganglio giugulare. Cerca i melanociti neri sulla superficie della giugulare come punto di riferimento visivo.
  6. Tagliare gli attacchi nervosi tra la massa gangliare vagale ed estrarre l'intera massa gangliare tirando delicatamente l'estremità periferica del nervo vago mentre contemporaneamente si taglia il ganglio giugulare verso il tronco cerebrale con piccole forbici a molla (Tabella dei materiali).
  7. Rimuovere il tessuto congiuntivo e il grasso che si attaccano il più possibile al nervo vago e alla massa gangliare.
  8. Poiché è facile perdere un ganglio durante il trasferimento da un tubo all'altro, mantenere ~ 0,5 cm del nervo vago per facilitare la manipolazione e la localizzazione dei campioni.
  9. Posizionare i gangli con l'aiuto di pinze fini in tubi microcentrifuga da 1,5 ml e incubare a 4 °C in formalina per 24 ore e con il 30% di saccarosio per altre 24 ore.
  10. Posizionare i gangli all'interno di una piccola goccia (~4 mm Ø) del mezzo a temperatura di taglio ottimale (OCT) su un pezzo di foglio di alluminio. Quindi, congelare il campione su un letto di ghiaccio secco.
  11. Tagliare i campioni con un criostato a -20 °C in sezioni di spessore 14 μm e raccoglierli su vetrini per microscopio in vetro come 3 serie a 42 μm di distanza.
    NOTA: evitare di posizionare sezioni vicino ai bordi della diapositiva. Per risparmiare i reagenti, mantenere le sezioni di tessuto il più strettamente imballate possibile ma senza sovrapposizioni.
  12. Conservare i campioni in un congelatore a -80 °C fino a quando non sarà necessario per ISH per almeno 6 mesi.
    NOTA: fare riferimento alla Figura 1 per la risoluzione dei problemi relativi alla fluorescenza endogena.

2. Pretrattamento e ISH

  1. Prima del giorno degli esperimenti, vetreria da laboratorio in autoclave da utilizzare per ISH, compresi i piatti di colorazione e i barattoli tampone di lavaggio.
    NOTA: mentre lavorare in condizioni di assenza di RNasi non è critico, indossare i guanti in ogni momento. Tenere le bottiglie di soluzionedidecontaminazione RNase ( Table of Materials ) a portata di mano nel caso in cui si sospetti una contaminazione.
  2. Il primo giorno, portare le diapositive a temperatura ambiente su una panca appositamente dedicata all'ISH. Risciacquare i vetrini in 1x PBS e cuocerli per 30 minuti a 60 °C in un forno da forno (Tabella dei materiali).
  3. Post-fissare i vetrini in formalina al 4% per 15 minuti a 4 °C.
  4. Portare i reagenti nel kit multiplex (Table of Materials) a temperatura ambiente.
  5. Disidratare i vetrini in etanolo al 50%, 70% e 100% per 5 minuti ciascuno. Applicare lasoluzioneH 2 O2 sui campioni per 10 minuti e quindi risciacquare in acqua a doppia distillazione (ddH2O).
  6. Trattare i campioni con il reagente di recupero target per 5 minuti, risciacquare in ddH2O seguito da etanolo al 100% e asciugare all'aria. Usando una penna idrofoba, crea una barriera attorno ai campioni.
    NOTA: Non applicare la barriera idrofobica troppo vicino alle sezioni di tessuto.
  7. Applicare la proteasi per 30 min a 40 °C in un forno di ibridazione (Tabella dei materiali).
  8. Nel frattempo, preriscaldare le sonde a 40 °C e raffreddarle a temperatura ambiente prima dell'uso. Incubare i vetrini con la combinazione desiderata di sonde bersaglio (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; o Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) per 2 ore a 40 °C in un forno di ibridazione.
  9. Incubare il tessuto di controllo negativo con la sonda C1 bersaglio della diidrodipicolinato reduttasi (DapB) per 2 ore a 40 °C in un forno di ibridazione.
  10. Risciacquare i vetrini nel tampone di lavaggio e conservare durante la notte in 5x citrato salino di sodio (SSC) a temperatura ambiente. Per comodità, dividi l'esperimento in due giorni. Il giorno seguente, sciacquare i vetrini con tampone di lavaggio e incubarli con i reagenti di amplificazione elencati di seguito (vedere il manuale d'uso in Tabella dei materiali).
  11. Applicare AMP1 (30 min a 40 °C), AMP2 (30 min a 40 °C) e AMP 3 (15 min a 40 °C). Risciacquare nel tampone di lavaggio tra ogni passaggio.
  12. Sciogliere ogni colorante opale (Tabella dei materiali) in dimetilsolfossido e conservare le soluzioni a 4 °C fino a quando necessario.
  13. Per il canale 1, incubare i vetrini con HRP-C1 (15 min a 40 °C) e Opal 520 (colore verde; diluizione 1/1.500; 30 minuti a 40°C). Risciacquare nel tampone di lavaggio tra ogni passaggio.
  14. Per il canale 2, incubare i vetrini con HRP-C2 (15 min a 40 °C) e Opal 570 (colore giallo; diluizione 1/1.500; per 30 min a 40 °C). Risciacquare nel tampone di lavaggio tra ogni passaggio.
  15. Per il canale 3, incubare i vetrini con HRP-C3 (15 min a 40 °C) e Opal 690 (colore rosso lontano; diluizione 1/1.500; per 30 min a 40 °C). Risciacquare nel tampone di lavaggio tra ogni passaggio.
  16. Lavare i vetrini ed esporli a 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 30 s.
  17. Applicare immediatamente il mezzo di montaggio su ogni diapositiva e posizionare una copertura sulla sezione del tessuto.
  18. Tenere i tessuti orizzontali in un supporto per vetrini a 4 °C fino all'imaging.

3. Microscopia e analisi dei dati

NOTA: i dati ISH multiplex possono essere ripresi con una vasta gamma di strumenti con i filtri appropriati. Tuttavia, un metodo di imaging preferito è la microscopia confocale con obiettivi 20x e 63x (olio); fare riferimento alla discussione per i motivi. Fare riferimento alla Figura 2 per la determinazione del rapporto segnale-rumore ottimale.

  1. Utilizzare un microscopio confocale dotato di linee laser 488, 561 e 633 nm. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione (vedi Tabella 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, campo di rilevamento 668-696 nm, potenza 2.0, guadagno 724); Opal 570 (laser DPSS 561 nm, campo di rilevamento 579-627 nm,
  2. Per migliorare la qualità delle immagini, acquisire con una linea media di 4 e una dimensione in pixel di almeno 1024 x 1024.
    NOTA: i parametri di cui sopra sono forniti solo a titolo esemplificativo e le modifiche sono consigliate a seconda di uno strumento, ingrandimento (20x o 63x), livelli di espressione e livelli endogeni di fluorescenza per un dato tessuto.
  3. Una volta soddisfatti dei parametri di acquisizione, raccogliere le immagini utilizzando le stesse impostazioni. Attribuire falsi colori a ciascun canale per facilitare la visualizzazione.
    NOTA: ad esempio, rosso (Phox2b o Prdm12), ciano (Cck1r), giallo (Ghsr) e grigio (DAPI).
  4. Eseguire il conteggio delle cellule utilizzando le immagini digitali identificando il contorno dei profili positivi dell'RNAscopio con un nucleo leggermente macchiato con DAPI. Calcolare la percentuale di profili RNAscope-positivi che esprimono ogni trascrizione [Figura 3A-C].
  5. Per migliorare il rigore e l'accuratezza delle stime, contare almeno 2.000 profili neuronali di almeno 4 animali diversi. Eseguire il conteggio dai gangli sinistro e destro separatamente.
  6. Inserisci i dati in un grafico a torta con il numero totale di profili contati.
  7. Utilizza il software di imaging per acquisire immagini e cucire insieme immagini 20x. Usa ImageJ-Fiji e un altro software di foto e design per generare le lastre finali. Applica regolazioni uniformi al contrasto e alla luminosità a tutte le immagini.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Mentre RNAScope può essere applicato ad animali di qualsiasi età, sesso o background genetico, è consigliabile lavorare con giovani adulti (<3 mesi). Questo perché gli artefatti fluorescenti (ad esempio, lipofuscina) sono risultati comuni nei neuroni di animali più anziani41. I gangli fissati in formalina dei topi più anziani contengono spesso una fluorescenza endogena sorprendentemente intensa che può essere facilmente scambiata per una colorazione genuina (Figura 1A

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

La tecnica di ISH è stata inventata alla fine del 196042. Tuttavia, non è fino alla metà degli anni 1980 che è stato applicato per il rilevamento di mRNA nel sistema nervoso centrale e periferico43,44. Considerando l'eterogeneità del sistema nervoso e i problemi ricorrenti con gli anticorpi, localizzare un particolare trascritto a livello cellulare rimane uno strumento inestimabile. Tuttavia, i metodi ISH tradizionali sono rimasti laborios...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core finanziato dalla sovvenzione NIH #5P01DK119130-02. Gli autori desiderano riconoscere l'assistenza della UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (guidata dal Dr. Phelps) e del suo staff (Abhijit Bugde e Marcel Mettlen), supportati in parte dal NIH Grant #1S10OD021684-01, una risorsa condivisa dell'Harold C. Simmons Cancer Center, supportata in parte da una sovvenzione di supporto ncI Cancer Center, P30 CA142543.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x PBSFisher ScientificBP399-4
20x SSCInvitrogenAM9763-80
° C congelatorePHCBIMDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021Adobesoftware fotografico e di progettazione
Forno di cotturaThermo ScientificModello: 658
Microscopio confocaleZeissLSM880 Airyscan
Vetro di coperturaBrain Research Laboratories2460-1.5D
CryostatLeicaCM 3050 S
Dumont #5 PinzeF.S.T.11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897Lmezzo di montaggio
HybEZ fornodi ibridazione
Penna idrofobicaVector LaboratoriesH-4000
ImageJ-FijiNIH
Forbici grandiHenry Schein100-7561
Micro provette per centrifugaVWR20170-333
Minipompa a flusso variabileFisher Scientific13-876-1
Opal 520Akoya biosciencesFP1 1487001KTBiomarcatore fluorescente
Opal 570Akoya biosciencesFP1 1488001KTBiomarcatore fluorescente
Opal 690Akoya biosciencesFP1 1497001KTBiomarcatore fluorescente
ProLong Gold Mezzoper cellule marcate in fluorescenza
Kit di reagenti fluorescenti RNAscope Multiplex v2ACD /Bio-Techne323100Kit multiplex
Sonda RNAscope Mouse Cck1r-C3ACD /Bio-Techne313751-C3
Sonda RNAscope Mouse DapBACD /Bio-Techne310043
Sonda RNAscope Mouse GhsrACD /Bio-Techne
Sonda RNAscope Topo Phox2b-C2ACD /Bio-Techne407861-C2
Sonda RNAscope Topo Prdm12-C2ACD /Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020Rnase soluzione decontaminante
Piccole forbici da dissezioneMillipore SigmaZ265977
vetriniSuperfrost PlusFisherbrand1255015
Tissue Tek OCT mediumSakura4583
Manuale utenteACD323100 USM
Vannas Forbici a mollaRobozRS 5620
ZEN Software di imagingZeiss
di montaggio antidissolvenza 426141

Riferimenti

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344(2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985(2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986(2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415(2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022(2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035(2020).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Recettori accoppiati a proteine GISH multiplexgangli nodosi giugularitecnologia RNAscopemicroscopia confocalerecettore della colecistochininarecettore della grelinamarcatore Phox2b
Rilevazione dell'espressione del recettore accoppiato alla proteina G nei neuroni afferenti vagali di topo utilizzando l'ibridazione multiplex in situ
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.