Utilizzo di Phage Display per sviluppare modulatori varianti di ubiquitina per le ligasi E3

Summary

L'ubiquitinazione è una modificazione post-traduzionale critica della proteina, la cui disregolazione è stata implicata in numerose malattie umane. Questo protocollo descrive in dettaglio come la visualizzazione dei fagi può essere utilizzata per isolare nuove varianti di ubiquitina in grado di legare e modulare l'attività delle ligasi E3 che controllano la specificità, l'efficienza e i modelli di ubiquitinazione.

Abstract

L'ubiquitina è una piccola proteina da 8,6 kDa che è un componente fondamentale del sistema ubiquitina-proteasoma. Di conseguenza, può legarsi a una vasta gamma di proteine con elevata specificità ma bassa affinità. Attraverso la visualizzazione dei fagi, le varianti di ubiquitina (UbV) possono essere progettate in modo tale da mostrare una migliore affinità rispetto all'ubiquitina wildtype e mantenere la specificità di legame alle proteine bersaglio. Il display dei fagi utilizza una libreria fagemidica, in cui la proteina del mantello pIII di un batteriofago filamentoso M13 (scelto perché visualizzato esternamente sulla superficie del fago) viene fuso con UbV. I residui specifici di ubiquitina wildtype umana sono morbidi e randomizzati (cioè, c'è una propensione verso la sequenza wildtype nativa) per generare UbV in modo che vengano evitati cambiamenti deleteri nella conformazione proteica introducendo la diversità necessaria per promuovere nuove interazioni con la proteina bersaglio. Durante il processo di visualizzazione dei fagi, questi UbV vengono espressi e visualizzati sulle proteine del rivestimento fagico e panned contro una proteina di interesse. Gli UbV che mostrano interazioni di legame favorevoli con la proteina bersaglio vengono mantenuti, mentre i leganti poveri vengono lavati via e rimossi dal pool della biblioteca. Gli UbV trattenuti, che sono attaccati alla particella fagica contenente il fagemide corrispondente dell'UbV, sono eluiti, amplificati e concentrati in modo che possano essere panned contro la stessa proteina bersaglio in un altro round di visualizzazione dei fagi. Tipicamente, vengono eseguiti fino a cinque cicli di visualizzazione dei fagi, durante i quali viene imposta una forte pressione di selezione contro gli UbV che si legano debolmente e / o promiscuamente in modo che quelli con affinità più elevate siano concentrati e arricchiti. In definitiva, gli UbV che dimostrano una maggiore specificità e/o affinità per la proteina bersaglio rispetto alle loro controparti wildtype sono isolati e possono essere caratterizzati attraverso ulteriori esperimenti.

Introduction

Comprendere i dettagli molecolari delle interazioni proteina-proteina è fondamentale per delineare i meccanismi di trasduzione del segnale dei processi biologici, in particolare quelli che contribuiscono a malattie clinicamente importanti. Negli ultimi anni, la visualizzazione dei fagi è stata utilizzata come metodo pratico e accessibile per isolare proteine / peptidi con un legame molto migliorato a una proteina bersaglio ^{desiderata1,2,3,4}, che a sua volta può essere utilizzata come sonde intracellulari di interazioni proteina-proteina.

L'ubiquitinazione è una cascata di attività enzimatiche (enzima attivante E1 → enzima coniugante E2 → ligasi E3) che coniugano covalentemente l'ubiquitina (Ub) a substrati proteici per indirizzarli alla degradazione o per mediare i cambiamenti di segnalazione cellulare. Inoltre, le deubiquitinasi catalizzano la rimozione dell'ubiquitina dalle proteine. Pertanto, nelle cellule, ci sono migliaia di interazioni proteina-proteina ub-dipendenti, la stragrande maggioranza delle quali riconosce una superficie comune con bassa affinità ma alta specificità per consentire interazioni deboli attraverso superfici ampie e diverse.

Ernst et al. hanno introdotto mutazioni in regioni di legame note di Ub per vedere se potevano migliorare l'affinità di legame per una proteina di interesse pur mantenendo un'elevata ^{selettività5}. È stata sviluppata una libreria combinatoria di oltre 10 miliardi (7,5 x ¹⁰¹⁰) varianti di Ub (UbV) con mutazioni in posizioni sulla superficie Ub che mediano le interazioni Ub-proteina conosciute. Questa libreria consisteva di fagemidi che esprimono la proteina del rivestimento del batteriofago M13 pIIII fusa in UbV diversificati. Pertanto, i singoli UbV possono essere visualizzati sulla superficie del fago tramite la proteina del mantello al momento dell'espressione. Durante il processo di selezione, i fagi che mostrano UbV con notevoli interazioni di legame con la proteina bersaglio saranno mantenuti e arricchiti nei successivi cicli di visualizzazione dei fagi, mentre i fagi che mostrano UbV che si legano male alla proteina bersaglio vengono lavati via e rimossi dal pool fagico. Le particelle di fagi trattenute contengono il fagemino corrispondente al loro UbV visualizzato, consentendo loro di essere sequenziati e ulteriormente caratterizzati una volta isolati.

Utilizzando questa strategia di ingegneria proteica, sono stati sviluppati inibitori UbV per le deubiquitinasi ^umane5 e le proteasi ^virali6. È importante sottolineare che abbiamo generato UbV inibitori per le ligasi E3 della famiglia HECT umana attraverso il dirottamento del sito di legame E2 e l'attivazione di UbV che occupano un esosite Ub-binding sul dominio ^HECT7. Possiamo anche inibire gli E3 monomerici della famiglia RING prendendo di mira il sito di legame E2 e indurre la dimerizzazione UbV per attivare l'ANELLO omodimerico ^E3s8. Per gli RING E3 multi-subunità, gli UbV possono ottenere l'inibizione prendendo di mira la subunità RING (ad esempio, per il complesso APC/ ^C9) o interrompendo la formazione di complessi (ad esempio, per SCF ^E3s10). Collettivamente, gli UbV possono essere sfruttati per interrogare sistematicamente le interazioni proteina-proteina nel sistema Ub-proteasoma (UPS) in modo da poter decifrare meglio i meccanismi biochimici degli enzimi UPS e identificare e convalidare i siti funzionali per l'intervento terapeutico.

Il seguente protocollo descrive come impiegare una libreria UbV visualizzata da fagi generati in precedenza per indirizzare una proteina di interesse e come arricchire i leganti UbV che interagiscono con la proteina bersaglio attraverso cicli successivi di visualizzazione dei fagi.

Protocol

1. Preparazione del reagente

1. PBS (soluzione salina tamponata con fosfato): mescolare 50 mL di soluzione 10x PBS con 450 mL di _H2O ultrapuro. Sterilizzare mediante filtrazione e conservare a 4 °C o temperatura ambiente (~20-25 °C).
2. 10% BSA (albumina sierica bovina): aggiungere lentamente 1 g di BSA a 7 ml di _H2O ultrapuro e mescolare fino a completa dissoluzione (senza grumi). Ricaricare con _H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 10 ml. Sterilizzare per filtrazione e conservare a 4 °C.
3. Tampone PB (PBS integrato con BSA all'1%): aggiungere lentamente 5 g di BSA a 400 ml di _H2O ultrapuro e 50 ml di PBS e mescolare fino a completa dissoluzione (senza grumi). Ricaricare con _H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 500 ml. Sterilizzare per filtrazione e conservare a 4 °C.
4. Tampone PBT (PBS integrato con 1% BSA e 0,05% Tween 20): aggiungere lentamente 5 g di BSA a 400 mL di _H2O ultrapuro e 50 ml di PBS e mescolare fino a completa dissoluzione (senza grumi). Aggiungere 250 μL di Tween 20. Ricaricare con _H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 500 ml. Sterilizzare per filtrazione e conservare a 4 °C.
5. Buffer PT (PBS integrato con 0,05% Tween 20): Mescolare 1 mL di Tween 20 con 400 mL di PBS. Rabboccare con _H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 2 L. Sterilizzare per filtrazione e conservare a 4 °C o temperatura ambiente (~20-25 °C).
6. Brodo 2YT: Aggiungere 16 g di triptone, 10 g di estratto di lievito e 5 g di NaCl a 800 ml di _H2O ultrapuro e mescolare fino a completa dissoluzione (senza grumi). Rabboccare con _H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 1 L. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente (~20-25 °C).
7. Piastre LB/carb: aggiungere 12,5 g di miscela LB prefabbricata e 7,5 g di agar a 400 mL di _H2O. Ricaricare con _H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 500 ml e sterilizzare in autoclave. Assicurarsi che l'agar sia completamente sciolto e attendere che si raffreddi al di sotto dei 60 °C. Aggiungere 500 μL di 100 mg di ml di carbenicillina, mescolare bene e versare nel piatto. Conservare a 4 °C.
8. LB/piastre tet: Aggiungere 12,5 g di miscela LB prefabbricata e 7,5 g di agar a 400 mL di _H2O ultrapuro. Rabboccare con _H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 500 ml e sterilizzare in autoclave. Assicurarsi che l'agar sia completamente sciolto e attendere che si raffreddi al di sotto dei 60 °C. Aggiungere 500 μL di tetraciclina da 10 mg di mL, mescolare bene e versare nel piatto. Conservare a 4 °C.
9. 20% PEG (polietilenglicole)/2,5 M NaCl: Aggiungere 50 g di PEG-8000 e 36,5 g di NaCl a 200 mL di _H2O ultrapuro. Mescolare fino a completa dissoluzione.
   NOTA: questa operazione potrebbe richiedere del tempo; il riscaldamento può aiutare. Ricaricare con _H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 250 ml. Sterilizzare per filtrazione o autoclave.
10. 0,1 M HCl: Mescolare 20 mL di 1 M HCl con 180 mL di _H2O ultrapuro. Sterilizzare per filtrazione e conservare a temperatura ambiente (~20-25 °C).
11. 1 M Tris (pH 11,0): Aggiungere 6,1 g di base Tris a 40 mL di _H2O ultrapuro. Regolare il pH a 11,0 con HCl e mescolare fino a completa dissoluzione di Tris. Ricaricare con _H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 50 ml. Sterilizzare per filtrazione e conservare a temperatura ambiente (~20-25 °C).
12. 100 mg/mL (1000x) di carbenicillina: Aggiungere 2 g di sale disodico di carbenicillina a 20 mL di _H2O ultrapuro. Mescolare fino a completa dissoluzione. Sterilizzare per filtrazione e conservare a -20 °C.
13. 50 mg/mL (1000x) kanamicina: Aggiungere 1 g di kanamicina solfato a 20 mL di _H2O ultrapuro. Mescolare fino a completa dissoluzione. Sterilizzare per filtrazione e conservare a -20 °C.
14. 10 mg/mL (1000x) tetraciclina: aggiungere 0,2 g di tetraciclina cloridrato a 20 ml di etanolo al 70%. Mescolare fino a completa dissoluzione. Sterilizzare per filtrazione e conservare a -20 °C.

2. Preparazione proteica

1. Determinare la concentrazione dello stock proteico target in μM. Il modo più conveniente per valutare la concentrazione proteica è misurare l'assorbanza dello stock proteico a 280 nm. Se la concentrazione è nota in mg/mL, convertirla in μM utilizzando il peso molecolare della proteina bersaglio. Una gamma di metodi può essere utilizzata a seconda della proteina di interesse; vedere la sezione Discussione per i dettagli.
   NOTA: se la proteina è troncata (dominio/motivo proteico specifico) o etichettata, ricordarsi di tenere conto di queste variazioni del peso molecolare durante la conversione da mg/mL a μM.
2. Preparare tre tubi microcentrifuga etichettati "round 1", "round 2/3" e "round 4/5".
   1. Calcolare il volume di proteine necessario per diluirlo a 1 μM in 800 μL PBS e aliquotare questo volume nei tubi senza aggiungere PBS.
      NOTA: se la quantità di proteina bersaglio disponibile è bassa, la concentrazione può essere abbassata a un minimo di 0,25 μM.

3. Preparazione per il primo turno di selezione

1. Preparare una coltura di semi per la coltura dell'input del fago per il secondo round di selezione.
   1. Inoculare 5 mL di 2YT/tet con una colonia di Escherichia coli ben isolata e incubare durante la notte a 37 °C con scuotimento orbitale a 200 rpm.
2. Rivestire il piatto per il primo turno di selezione.
   1. Diluire la proteina bersaglio nel tubo "round 1" con la quantità appropriata di PBS e aliquota 100 μL in otto pozzetti di una piastra legante a 96 pozzetti (cioè la piastra bersaglio).
      NOTA: la visualizzazione dei fagi può essere eseguita per quattro diverse proteine contemporaneamente su una singola piastra rivestendo i pozzetti negli angoli della piastra.
   2. Controllo opzionale: se la proteina bersaglio è etichettata, ad esempio con GST o MBP (proteina legante il maltosio), rivestire otto pozzetti in un'altra piastra legante a 96 pozzetti con 100 μL di una soluzione da 1 μM contenente il tag epitopo appropriato. Questo verrà utilizzato per rimuovere i fagi indesiderati che si legano al tag in modo non specifico.
   3. Agitare le piastre durante la notte a 4 °C con agitazione orbitale a 200 giri/min.

4. Primo turno di selezione

1. Preparare l'input del secondo round.
   1. Inoculare 30 mL di 2YT/tet con 200 μL della coltura di semi dal punto 3.1.
   2. Incubare a 37 °C con scuotimento orbitale a 200 giri/min fino a quando i batteri sono in fase mid-log (_OD600 0,6 - 0,8). Questo richiede circa tre ore.
2. Blocca la piastra di destinazione.
   1. Rimuovere la soluzione di rivestimento dalla piastra, o entrambe le piastre se è stata realizzata una piastra di controllo, invertendo e scuotendo su un lavandino. Asciugare su carta assorbente.
   2. Aggiungere 300 μL di tampone PB a ciascun pozzetto rivestito.
   3. Rimuovere il buffer PB come nel passaggio 4.2.1 e aggiungere altri 200 μL di buffer PB.
   4. Incubare a temperatura ambiente (~20-25 °C) per 1 ora con scuotimento orbitale a 300 giri/min.
3. Preparare la libreria dei fagi.
   1. Scongelare la libreria di fagi sul ghiaccio e diluirla a 100 volte la diversità della libreria in PBS. Ad esempio, se la diversità della libreria è 1 x ¹⁰¹⁰ e la concentrazione della libreria è 1 x ¹⁰¹³, diluire la libreria in modo che la concentrazione sia 1 x ¹⁰¹². Per le librerie qui utilizzate, diluirle 10 volte in PBS combinando 1 mL della libreria con 9 mL di PBS.
      NOTA: la diversità della libreria dovrebbe essere stata determinata durante la creazione della libreria e non può essere facilmente valutata altrimenti. La concentrazione della libreria può essere determinata inoculando cellule di E. coli in fase mid-log (_OD600 0,6 - 0,8) e placcando su LB / carb.
   2. Aggiungere 1/5 di volume di PEG/NaCl. Ad esempio, per 10 mL della libreria precedentemente diluita, aggiungere 2 mL di PEG/NaCl.
   3. Incubare sul ghiaccio per 30 min.
   4. Centrifugare a 11.000 x g per 30 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e rifiltrare per 2 minuti per abbattere il surnatante rimanente.
      NOTA: Mettere il tubo nel rotore nello stesso orientamento la seconda volta in quanto è stato il primo a mantenere il pellet nello stesso posto, quindi, rendendolo più facile da vedere.
   5. Risospendare delicatamente il pellet di fagi in 1 mL di PBT per proteina. Per quattro proteine, risospesare il pellet in 4 ml di PBT.
      NOTA: Cercare di non toccare il pellet e non introdurre bolle d'aria.
4. Mostra il fago alle proteine bersaglio.
   1. Controllo opzionale: aggiungere 100 μL di libreria di fagi a ciascun pozzetto rivestito nella piastra di controllo. Incubare a temperatura ambiente (~20-25 °C) per 1 ora con scuotimento orbitale a 300 rpm e trasferire la libreria dalla piastra di controllo alla piastra di destinazione. Saltare il passaggio 4.4.2.
   2. Rimuovere il buffer PB dalla piastra di destinazione come nel passaggio 4.2.1 e aggiungere 100 μL della libreria di fagi a ciascun pozzetto rivestito.
   3. Incubare a temperatura ambiente (~20-25 °C) per 1 ora con scuotimento orbitale a 300 giri/min.
5. Elute intorno a un fago.
   1. Rimuovere la libreria di fagi e lavare i pozzetti rivestiti quattro volte con tampone PT. Capovolgere il piatto e toccare un tovagliolo di carta per rimuovere le ultime gocce.
      NOTA: se più proteine bersaglio sono rivestite su una piastra, cercare di ridurre al minimo il flusso di tutte le soluzioni successive tra i pozzetti.
   2. Aggiungere 100 μL di 0,1 M HCl a ciascun pozzetto rivestito e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti con scuotimento orbitale a 300 giri/min.
   3. Neutralizzare il pH aggiungendo 12,5 μL di 1 M Tris-HCl (pH 11) a ciascun pozzo rivestito.
   4. Raggruppare il fago eluito da tutti gli 8 pozzi in un singolo tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Pipettare su e giù durante il trasferimento per rendere omogenee le soluzioni e aspirare tutto il liquido dai pozzetti.
   5. Aggiungere il 10% di BSA al fago eluito aggregato ad una concentrazione finale dell'1%. Per un tipico volume di eluizione rotondo di 950 μL, aggiungere 95 μL di BSA al 10%. Conservare a 4 °C. Questo è l'output del primo round.

5. Preparazione per i successivi turni di selezione

1. Preparare una coltura di semi per la coltivazione dell'input fagico per il prossimo ciclo di selezione come nel passaggio 3.1.
2. Rivestire la piastra per il terzo turno di selezione come nel passaggio 3.2 con le modifiche indicate di seguito.
   1. Rivestire solo quattro pozzetti per proteina in una piastra legante a 96 pozzetti. Utilizzare metà del contenuto dei tubi "round 2/3" o "round 4/5" per il round appropriato. Diluire il contenuto di questi tubi secondo necessità, al fine di evitare che le proteine si depositino dalla soluzione.
3. Preparare l'input del fago per il prossimo round di selezione.
   1. Utilizzare metà dell'output del primo round dal passaggio 4.5.5 per inoculare 3 mL di celle di fase mid-log dal passaggio 4.1. Per un tipico round one output, inoculare con 500 μL di uscita.
   2. Incubare a 37 °C per 30 minuti con scuotimento orbitale a 200 giri/min.
   3. Aggiungere il fago helper M13K07 ad una concentrazione finale di 1 x ¹⁰¹⁰ PFU/mL.
   4. Incubare a 37 °C per 1 ora con scuotimento orbitale a 200 giri/min.
   5. Trasferire l'intero 3 mL di coltura a 30 mL di 2YT/carb/kan. Crescere durante la notte a 37 °C con scuotimento orbitale a 200 giri/min.
   6. Il giorno successivo, trasferire la coltura in un tubo centrifuga da 50 ml e centrifugare a 11.000 x g per 10 minuti a 4 °C per precipitare le cellule.
   7. Decantare il surnatante in un nuovo tubo di centrifuga da 50 mL e mescolare con 8 mL di PEG/NaCl e incubare sul ghiaccio per 10 min.
   8. Centrifugare a 11.000 x g per 10 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e centrifugare nuovamente per 2 minuti.
      NOTA: Mettere il tubo nel rotore nello stesso orientamento la seconda volta in quanto è stato il primo a mantenere il pellet nello stesso posto, quindi, rendendolo più facile da vedere.
   9. Risospesci il pellet di fagi in 800 μL di PBT in modo che sia completamente omogeneo e non siano visibili grumi.
   10. Trasferire la soluzione di fagi in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e centrifuga a 16.200 x g per 4 minuti a 4 °C in detriti di pellet.
   11. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga. Questo è l'input per il prossimo turno di selezione.
4. Opzionale: titolare le soluzioni di input e output.
   1. Utilizzare 500 μL di una coltura di semi di E. coli per inoculare 5 mL di 2YT/tet e incubare a 37 °C con scuotimento orbitale a 200 rpm fino a quando i batteri sono in fase mid-log (OD600 0,6 - 0,8). Ci vogliono circa 1 h.
   2. Diluire le soluzioni di ingresso/uscita dei fagi a ^10-3 - ^10-5 in PBS e aggiungere 10 μL di ogni diluizione a 90 μL di cellule coltivate.
      NOTA: utilizzare immediatamente soluzioni fagiche diluite perché il fago assorbirà al tubo nel tempo e le trasformazioni potrebbero produrre falsi negativi.
   3. Incubare a 37 °C per 20 minuti con agitazione orbitale a 200 giri/min.
   4. Piastra da 5 μL su piastre LB/carb separate.
      NOTA: la quantità placcata è variabile in base ai risultati precedenti / alle preferenze personali.

6. Successivi turni di selezione

1. Eseguire tutti i round successivi insieme alla preparazione come fatto nei passaggi 3 e 4, rispettivamente, con le differenze indicate di seguito.
   1. Utilizzare l'input prodotto nel round precedente come sorgente di fagi anziché come libreria. Rivestire 4 pozzetti per proteina bersaglio con 100 μL dell'input fagico acquisito dal round precedente. Conservare gli input fagici rimanenti a 4 °C.
   2. Rendere la fase di lavaggio in 4.5.1 più rigorosa con ogni turno di selezione. Il primo round richiede il lavaggio 4 volte, il secondo round richiede 6 volte, il terzo round richiede 8 volte e i round quattro e cinque richiedono entrambi il lavaggio 10 volte.
   3. Ridurre alcuni volumi rispetto a quelli utilizzati nel primo round perché i round successivi rivestono solo quattro pozzetti invece di otto. Ad esempio, nel passaggio 4.5.5 solo 45 μL del 10% di BSA vengono aggiunti all'output del fago e nel passaggio 5.3.1 solo 250 μL dell'output del fago vengono utilizzati per inoculare le cellule.

7. Elaborazione post selezione e isolamento dei fagi

1. Piastrellare le soluzioni di input e output per i round quattro e cinque.
   1. Se non è già stato fatto nel passaggio 5.4, seguire gli stessi passaggi per titer round quattro e cinque uscite di fagi, producendo idealmente una gamma di 30-300 colonie su alcune piastre.
2. Coltura e fago isolato.
   1. Aliquota 450 μL di 2YT/carb/M13K07 in ogni tubo di una scatola di coltura da 96 mini tubi.
   2. Scegli colonie ben isolate da una qualsiasi delle piastre dal passaggio 7.1 per inoculare ogni tubo.
      NOTA: utilizzare la metà superiore della casella per le uscite arrotondate quattro e la metà inferiore per le uscite round cinque.
   3. Incubare durante la notte a 37 °C con scuotimento orbitale a 200 giri/min.
   4. Centrifugare a 1.200 x g per 10 min a 4 °C.
   5. Trasferire il maggior numero possibile di surnatante in una nuova scatola di coltura a 96 mini tubi senza disturbare il pellet cellulare e scartare quello vecchio. Conservare a 4 °C.
   6. Dalla nuova scatola, trasferire 100 μL da ciascun tubo a una piastra non vincolante da 96 pozzetti contenente 100 μL di glicerolo al 50% in tutti i pozzetti. Mescolare bene e conservare a -80 °C come scorta di riserva.

Results

I leganti prodotti dal display dei fagi possono essere verificati e analizzati in molti modi. Si raccomanda di procedere prima con il sequenziamento del fago con primer che affiancano l'inserto diversificato nella libreria fagemimidica. Un esperimento di visualizzazione ideale dei fagi mostrerà una chiara inclinazione verso diverse sequenze (Figura 1). Saranno presenti anche altre sequenze ma con un conteggio inferiore, apparendo più come rumore di fondo. Nell'esempio fornito, dove la visual...

Discussion

Come accennato nel passaggio 2.1 (preparazione delle proteine), è possibile utilizzare una varietà di metodi per valutare la concentrazione proteica e ciascuno avrà vantaggi e svantaggi unici in base alla specifica proteina bersaglio utilizzata per la visualizzazione dei fagi. In precedenza è stata fornita una fonte di descrizioni e protocolli dettagliati per i metodi più ^diffusi11.

L'uso del fago trattenuto da un precedente ciclo di visualizzazione dei fagi come input ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema di mini provette Axygen (0,65 mL, sterile, 96/rack, 10 rack/confezione)	Fisher Scientific	14-222-198	Colture delle uscite dei fagi dopo il phage display.
BD Difco Terreni di coltura disidratati: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Preparazione delle piastre per la titolazione.
Albumina sierica bovina (BSA), Frazione V	BioShop Canada	ALB001	Componente tampone.
Sale disodico di carbenicillina 89,0-100,5% anidro	Millipore-Sigma	C1389-5G	Coltura di cellule infette da fagemidi.
Agitatore digitale compatto per micropiastre	Fisher Scientific	11-676-337	Agitazione delle piastre durante l'incubazione con la libreria dei fagi.
Nastro sigillante in alluminio per micropiastre Corning	Fisher Scientific	07-200-684	Sigillatura di stock di glicerolo fagico.
Agar Fisher disidratato	Scientific	DF0140-01-0	Preparazione delle piastre per la titolazione.
DS-11 Spettrofotometro/Fluorimetro	DeNovix	DS-11 FX+	Misura della concentrazione di proteine.
Greiner Bio-One CellStar Micropiastra a 96 pozzetti, non trattata, con fondo a U	Fisher Scientific	7000133	Conservazione di stock di glicerolo fagico.
Acido cloridrico	Fisher Scientific	A144-500	eluizione fagica.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chimicamente Competente E. coli	Fisher Scientific	C854003	Ceppo batterico per l'infezione da fagi.
Kanamicina solfato	Fisher Scientific	AAJ1792406	Coltura di cellule infette da fagi helper M13K07.
M13KO7 Aiutante Phage	New England Biolabs	N0315S	Consentire l'impacchettamento e la secrezione dei fagemidi.
MaxQ 4000 Agitatore orbitale da banco	Fisher Scientific	11-676-076	Coltura cellulare batterica.
Micropiastra Nunc MaxiSorp a 96 pozzetti, fondo piatto	Life Technologies	44-2404-21	Proteine immobilizzanti.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10X	Fisher Scientific	BP3994	Componente tampone/mezzo di risospensione fagico.
Film in poliestere per ELISA e incubazione	VWR	60941-120	Copertura delle micropiastre durante l'incubazione.
Polietilenglicole 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Precipitazione dei fagi.
Cloruro di sodio	Millipore-Sigma	S3014	Precipitazione dei fagi.
Provette sterili in plastica per coltura: Polipropilene traslucido	Fisher Scientific	14-956-1D	Input per la coltura dei fagi.
Tetraciclina cloridrato	Fisher Scientific	BP912-100	Coltura di cellule OmniMax E. coli.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Soluzione di fago eluito neutralizzante.
Triptone Polvere	Fisher Scientific	BP1421-2	Componente del terreno di crescita cellulare.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Componente tampone.
Estratto di lievito	Fisher Scientific	BP1422-2	Componente del terreno di crescita cellulare.