Approccio genetico inverso per identificare i regolatori della pigmentazione usando il pesce zebra

Babita Sharma; Yogaspoorthi J. Subramaniam; Desingu Ayyappa Raja; Ayush Aggarwal; Sridhar Sivasubbu; Vivek T. Natarajan

doi:10.3791/62955

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Articolo metodologico

Approccio genetico inverso per identificare i regolatori della pigmentazione usando il pesce zebra

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DOI:

10.3791/62955

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1 marzo 2022

Babita Sharma^*¹^,² , Yogaspoorthi J. Subramaniam^*¹^,² , Desingu Ayyappa Raja¹^,²^,³ , Ayush Aggarwal¹^,² , Sridhar Sivasubbu¹ , Vivek T. Natarajan¹^,²

¹CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, ²Academy of Scientific and Innovative Research, ³Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I regolatori delle funzioni dei melanociti governano le differenze visibili nel risultato della pigmentazione. Decifrare la funzione molecolare del gene candidato della pigmentazione rappresenta una sfida. Qui, dimostriamo l'uso di un sistema modello di zebrafish per identificare i candidati e classificarli in regolatori del contenuto di melanina e del numero di melanociti.

Abstract

I melanociti sono cellule derivate dalla cresta neurale specializzate presenti nella pelle epidermica. Queste cellule sintetizzano il pigmento di melanina che protegge il genoma dalle radiazioni ultraviolette nocive. Le perturbazioni nel funzionamento dei melanociti portano a disturbi pigmentari come piebaldismo, albinismo, vitiligine, melasma e melanoma. Zebrafish è un eccellente sistema modello per comprendere le funzioni dei melanociti. La presenza di melanociti pigmentati cospicui, la facilità di manipolazione genetica e la disponibilità di linee fluorescenti transgeniche facilitano lo studio della pigmentazione. Questo studio impiega l'uso di linee di zebrafish selvatiche e transgeniche che guidano l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) sotto i promotori mitfa e tyrp1 che segnano vari stadi dei melanociti.

Il silenziamento basato su morfolino dei geni candidati è ottenuto per valutare l'esito fenotipico sulla pigmentazione larvale ed è applicabile allo screening dei regolatori della pigmentazione. Questo protocollo dimostra il metodo dalla microiniezione all'imaging e alla dissezione basata sulla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) dei fenotipi utilizzando due geni candidati, l'anidrasi carbonica 14 (Ca14) e una variante istonica (H2afv), per valutare in modo completo l'esito della pigmentazione. Inoltre, questo protocollo dimostra la segregazione dei geni candidati in specificatori e differenziatori di melanociti che alterano selettivamente il numero di melanociti e il contenuto di melanina per cellula, rispettivamente.

Introduzione

Mentre l'uso della melanina per la fotoprotezione si è evoluto più volte in tutto il regno animale, i vertebrati hanno apparentemente perfezionato il processo. Le cellule produttrici di pigmenti dedicate con un elaborato macchinario per sintetizzare e contenere la melanina sono conservate dal pesce all'uomo¹. Tuttavia, il risultato della pigmentazione è drammaticamente vario, che varia nel colore alla ricetta e si presenta come modelli vivaci su tegumenti, pelle e capelli². Nonostante la diversità, il repertorio di geni coinvolti nella risposta alla pigmentazione è sorprendentemente conservato. I componenti principali de....