Articolo metodologico

Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine

DOI:

10.3791/62977

⸱

7 dicembre 2021

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta due tecniche per isolare i compartimenti subcellulari dei fotorecettori murini a bastoncello per l'analisi delle proteine. Il primo metodo utilizza retina viva e carta da filtro di cellulosa per separare i segmenti esterni dell'asta, mentre il secondo impiega retina liofilizzata e nastro adesivo per rimuovere gli strati del segmento interno ed esterno dell'asta.

Abstract

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I fotorecettori a bastoncello sono neuroni sensoriali altamente polarizzati con compartimenti distinti. Le aste di topo sono lunghe (~80 μm) e sottili (~2 μm) e sono impacchettate lateralmente nello strato più esterno della retina, lo strato di fotorecettore, con conseguente allineamento di compartimenti subcellulari analoghi. Tradizionalmente, il sezionamento tangenziale della retina piatta congelata è stato utilizzato per studiare il movimento e la localizzazione delle proteine all'interno di diversi compartimenti del bastoncello. Tuttavia, l'elevata curvatura della retina del topo dominante rende difficile il sezionamento tangenziale. Motivati dallo studio del trasporto proteico tra compartimenti, abbiamo sviluppato due metodi di peeling che isolano in modo affidabile il segmento esterno dell'asta (ROS) e altri compartimenti subcellulari per le macchie occidentali. Le nostre tecniche relativamente rapide e semplici forniscono frazioni arricchite e subcellulari specifiche per misurare quantitativamente la distribuzione e la ridistribuzione di importanti proteine fotorecettrici in barre normali. Inoltre, queste tecniche di isolamento possono anche essere facilmente adattate per isolare e studiare quantitativamente la composizione proteica di altri strati cellulari all'interno della retina sia sana che degenerata.

Introduzione

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Le cellule fotorecettrici a bastoncello, strettamente impacchettate nello strato più esterno della retina neurale, sono parte integrante della visione a luce fioca. Per funzionare come contatori di fotoni fedeli, le barre utilizzano una via di segnalazione basata sulla proteina G, chiamata fototrasduzione, per generare risposte rapide, amplificate e riproducibili alla cattura di singoli fotoni. Questa risposta alla luce alla fine innesca un cambiamento nella corrente sulla membrana plasmatica e viene successivamente segnalata al resto del sistema visivo1. Come suggerisce il nome, ogni cellula a bastoncello ha una forma distinta simile a un'asta e presenta una morfologia cellulare altamente polarizzata, costituita da un segmento esterno (OS), un segmento interno (IS), un corpo cellulare (CB) e un terminale sinaptico (ST). Ogni compartimento subcellulare ha specifici macchinari proteici (legati alla membrana e solubili), caratteristiche biomolecolari e complessi proteici che svolgono ruoli cruciali come la fototrasduzione visiva, la pulizia generale e la sintesi proteica e la trasmissione sinaptica2,3.

Oltre 30 anni fa, il movimento reciproco dipendente dalla luce delle proteine subcellulari, in particolare la trasducina (lontano dalla OS) e l'arrestina (verso la OS), è stato osservato per la prima volta4,5,6,7. All'inizio, questo fenomeno osservato è stato accolto con scetticismo, dovuto in parte alla vulnerabilità dell'immunoistochimica al mascheramento dell'epitopo8. Nei primi anni 2000, la traslocazione proteica dipendente dallo stimolo è stata confermata utilizzando una rigorosa e ardua tecnica di sezionamento fisico9. Il sezionamento tangenziale seriale della retina di roditore piatta congelata seguito da immunoblotting ha rivelato che la transtracina9,10, l'arrestina11,12 e la recuperina13 subiscono tutte una ridistribuzione subcellulare in risposta alla luce. Si ritiene che la traslocazione guidata dalla luce di queste proteine chiave di segnalazione non solo regoli la sensibilità della cascata di fototrasduzione9,14,15, ma possa anche essere neuroprotettiva contro i danni alla luce16,17,18. Poiché il trasporto di proteine guidato dalla luce nelle barre sembra essere molto significativo per la biologia e la fisiologia delle cellule dei bastoncelli, le tecniche che consentono l'isolamento di diversi compartimenti subcellulari per determinare la distribuzione delle proteine sono preziosi strumenti di ricerca.

Attualmente, ci sono alcuni metodi volti a isolare i compartimenti subcellulari dell'asta. Tuttavia, questi metodi possono essere lunghi e difficili da riprodurre, o richiedono una quantità considerevole di isolato retinico. I preparati del segmento esterno dell'asta (ROS) tramite centrifugazione a gradiente di densità19, ad esempio, sono comunemente usati per separare il ROS dall'omogeneizzato retinico. Questo metodo è ampiamente utilizzato per western blot, ma la procedura richiede molto tempo e richiede un minimo di 8-12 retina murina20. D'altra parte, il sezionamento tangenziale seriale della retina murina e di ratto congelata è stato implementato con successo nell'isolamento del sistema operativo, IS, CB e ST9,11,13. Tuttavia, questo metodo è tecnicamente impegnativo a causa della necessità di appiattire completamente la retina murina piccola e altamente curva per allineare gli strati retinici prima della sezione tangenziale. Poiché ci sono una pletora di modelli murini e topi transgenici che ricapitolano le malattie del sistema visivo, la creazione di una tecnica che separa in modo affidabile, rapido e facile i singoli compartimenti delle aste è promettente nel rivelare i processi fisiologici che si verificano in ciascun compartimento specializzato e i meccanismi che sono alla base dei processi visivi in salute e malattia.

Per facilitare queste indagini, descriviamo due metodi di peeling che isolano i compartimenti subcellulari delle aste più facilmente rispetto ai protocolli attuali. Il primo metodo di peeling, adattato da una tecnica per esporre cellule bipolari marcate fluorescentemente per la registrazione del patch clamp21, impiega carta da filtro in cellulosa per rimuovere sequenzialmente il ROS da una retina murina isolata e viva (Figura 1). Il secondo metodo, adattato da una procedura che isola i tre strati primari di cellule retiniche da una retina chick22 e frog23, utilizza nastro adesivo per rimuovere il ROS e il segmento interno dell'asta (RIS) da una retina liofilizzata (Figura 2). Entrambe le procedure possono essere completate in 1 ora e sono notevolmente facili da usare. Forniamo la convalida dell'efficacia di questi due protocolli di separazione per western blot utilizzando retina adattata al buio ed esposta alla luce da topi C57BL / 6J per dimostrare la traslocazione indotta dalla luce di transducina rod (GNAT1) e arrestina (ARR1). Inoltre, utilizzando il metodo di peeling del nastro, forniamo ulteriori prove che la nostra tecnica può essere utilizzata per esaminare e affrontare le incongruenze tra i dati di localizzazione delle proteine acquisiti dall'immunocitochimica (ICC) e i western blots. Nello specifico, la nostra tecnica ha dimostrato che: 1) l'isoforma della proteina chinasi C-alfa (PKCα) è presente non solo nelle cellule bipolari, ma anche nei ROS murini e nei RIS, anche se in basse concentrazioni24,25, e 2) la rodopsina chinasi (GRK1) è presente prevalentemente nel campione isolato di OS. Questi dati dimostrano l'efficacia delle nostre due tecniche di peeling per separare e quantificare specifiche proteine del bastoncello e della retina.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida istituzionali locali del comitato per la cura degli animali da ricerca della University of Southern California (USC).

1. Metodo di peeling retinico a cellule vive

  1. Preparazione di tamponi di Ames, carte da peeling e piatto di dissezione
    1. Utilizzando forbici a punta smussata (o tipo a forbice equivalente), tagliare la carta da filtro in cellulosa (grado 413) in rettangoli di circa 5 mm x 2,5 mm. Conservare le talee per un uso futuro.
    2. Preparare 1 L di tampone HEPES di Ames combinando una bottiglia di Ames' Medium, 2,38 g di HEPES e 0,877 g di NaCl. Sciogliere i reagenti in una bottiglia di vetro sterile con acqua ultrapura distillata e regolare l'osmolarità e il pH rispettivamente a 280 mOsm e 7,4. Filtrare per sterilizzare (dimensione dei pori 0,2 μm), sigillare il coperchio con pellicola di paraffina e conservare a 4 °C.
    3. Preparare 1 L di tampone bicarbonato di Ames combinando una bottiglia di Ames' Medium e 1,9 g di NaHCO3. Sciogliere i reagenti in una bottiglia di vetro sterile con acqua ultrapura distillata e regolare l'osmolarità e il pH rispettivamente a 280 mOsm e 7,4. Filtrare per sterilizzare (dimensione dei pori 0,2 μm), sigillare il coperchio con pellicola di paraffina e conservare a 4 °C.
      NOTA: I tamponi hepes e bicarbonato di Ames possono essere preparati in anticipo e conservati per 1 settimana a 4 °C.
    4. Nella parte inferiore di una piastra di Petri da 35 x 10 mm, creare un reticolo o un motivo a scacchiera con un bisturi (lama n. 11, 40 mm).
      NOTA: Il fondo strutturato della capsula di Petri mantiene l'occhio isolato e fluttuante in posizione durante la dissezione retinica.
  2. Dissezione della retina
    NOTA: per questa procedura, il tampone deve essere portato e mantenuto a temperatura ambiente (RT). Rinfrescare il tampone in bicarbonato di Ames ogni 15 minuti con il tampone di bicarbonato di Ames fresco carbogenato durante la dissezione. Questo mantiene il pH fisiologico necessario.
    1. Circa 15-20 minuti prima della dissezione, ossigenare il tampone HEPES di Ames in una bottiglia da laboratorio o media da 100 ml dotata di un adattatore per tappo per tubi e bollare il tampone bicarbonato di Ames con il 95% di O2 e il 5% di CO2 in una camera di incubazione tissutale e in una bottiglia da laboratorio o di supporto da 100 ml dotata di un adattatore per tappo di tubo.
    2. Eutanasia di un numero uguale di entrambi i sessi di topi C57BL / 6J (2-3 mesi) per inalazione di isoflurano o anidride carbonica (CO2) seguita da lussazione cervicale. Enucleare gli occhi con le forbici curve e posizionare gli occhi nella capsula di Petri strutturata di 35 x 10 mm riempita con tampone bicarbonato di Ames a bolle.
    3. Creare un oculare (Figura 1A) perforando un foro alla giunzione cornea-limbus con un ago da 18 G. Tagliare lungo il perimetro di questa giunzione usando forbici per l'iride a micro-dissezione per rimuovere la cornea di ciascun occhio. Separare la lente e l'umore vitreo da ciascun occhio usando una pinzetta e scartare.
    4. Isolare la retina dalla coppa dell'occhio staccando accuratamente il complesso epitelio pigmentato retinico (RPE)-sclera-coroide lontano dalla retina neurale. Scartare il complesso RPE-sclera-coroide. Assicurarsi che la retina non sia danneggiata durante la dissezione maneggiando solo i bordi.
    5. Trasferire la retina isolata utilizzando una pipetta di trasferimento ad ampio foro nel coperchio di un piatto da 60 x 15 mm riempito con tampone in bicarbonato di Ames a bolle.
    6. Orientare la retina a forma di emisfero concava verso l'alto (i fotorecettori sono rivolti verso il basso verso il fondo del piatto) e tagliare in due ogni retina (attraverso il nervo ottico) usando forbici per l'iride o un bisturi (lama n. 10, 40 mm). Tagliare i bordi curvi di ogni mezza retina per creare due rettangoli (Figura 1A).
      NOTA: Ridurre al minimo la curvatura di ogni retina dimezzata consente alla retina di appiattirsi meglio nelle successive fasi di peeling e produce un peeling accurato dello strato del segmento esterno dell'asta (ROS).
    7. Conservare la retina dimezzata nella camera di incubazione dei tessuti che viene continuamente bollata con il 95% di O2 e il 5% di CO2.
      NOTA: La retina isolata può essere conservata nel tampone di bicarbonato di Ames carbogenato per ~ 24 ore.
  3. Raccolta del segmento esterno dell'asta (ROS) mediante peeling della carta da filtro
    NOTA: Aggiornare il tampone HEPES di Ames ossigenato RT ogni 15-20 minuti durante il processo di peeling per mantenere il pH fisiologico necessario.
    1. Trasferire un rettangolo retinico dalla camera tissutale con una pipetta di trasferimento ad ampio foro e un pezzo di carta da filtro da 5 mm x 2,5 mm in una capsula di Petri da 35 x 10 mm riempita con il tampone HEPES di Ames con il 100% di O2.
    2. Orientare la retina partizionata concava verso l'alto e assicurarsi che i fotorecettori siano rivolti verso il basso verso il fondo del piatto. Afferrare leggermente i lati della retina dimezzata con una pinzetta e spostarla sopra la carta da filtro. Una volta che la retina è centrata sulla carta da filtro, spostare la carta da filtro verso l'alto in modo che la retina dimezzata tocchi la carta da filtro per creare l'adesione ROS-carta da filtro (Figura 1B).
      NOTA: Assicurarsi che lo strato di fotorecettore entri in contatto diretto con la carta da filtro.
    3. Sollevare con attenzione la carta da filtro con la retina attaccata dal buffer HEPES di Ames. Posizionare il lato inferiore della carta da filtro (il lato senza la retina) su un tovagliolo di carta e tamponare 2-3 volte per asciugare (Figura 1B).
    4. Aggiungere una goccia di HEPES di Ames sul lato della carta da filtro con la retina. Posizionare nuovamente la carta da filtro sul tovagliolo di carta per asciugare, come appena descritto. Ripeti questo processo altre due volte.
    5. Riposizionare la carta da filtro con la retina nella capsula di Petri. Usando una pinzetta, spingere delicatamente tutti i bordi della retina dimezzata verso l'alto e lontano dalla carta da filtro su tutti i lati.
    6. Staccare delicatamente la retina dalla carta da filtro. Toccare solo il perimetro estremo della retina durante il processo di peeling per preservare l'integrità strutturale della retina.
    7. Sollevare la carta da filtro dalla capsula di Petri e rimuovere il liquido in eccesso su un tovagliolo di carta. Assicurarsi che il lato che era in contatto con la retina non contatti il tovagliolo di carta.
    8. Posizionare la carta da filtro con lo strato ROS parziale in un tubo etichettato su ghiaccio (Figura 1B). Tenere la retina sbucciata immersa nel tampone HEPES di Ames.
    9. Ripetere il processo di peeling per questa retina dimezzata circa 7-8 volte per rimuovere l'intero strato ROS. Dopo ogni peeling, posizionare la carta da filtro nello stesso tubo, che conterrà il ROS isolato da una retina dimezzata.
      NOTA: Fare attenzione a non strappare la retina dimezzata quando la si stacca dalla carta da filtro, poiché la retina diventa più sottile durante questo processo.
    10. Posizionare il tubo contenente tutte le bucce di carta da filtro del ROS isolato su ghiaccio per un uso immediato o congelare direttamente sul ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
    11. Utilizzare una pinzetta per trasferire la retina pelata rimanente (priva di ROS) in un tubo opportunamente etichettato. Posizionare il tubo su ghiaccio per un uso immediato o congelare con ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
    12. Ripetere il processo di peeling per ogni retina dimezzata ed etichettare accuratamente ogni tubo.

2. Metodo di peeling della retina liofilizzata

  1. Tamponi, mezzo peeling, preparazione del piatto di dissezione e set-up liofilizzatore
    1. In una bottiglia da 1 L, preparare la soluzione di Ringer aggiungendo 500 ml di acqua ultrapura distillata. Sciogliere i reagenti per raggiungere una concentrazione finale di 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES e 0,02 mM EDTA. Regolare il pH a 7,4 con NaOH, aggiungere acqua ultrapura per portare il volume finale a 1 L e regolare l'osmolarità a 313 mOsm.
    2. Prima dell'uso, filtrare la soluzione di Ringer con un filtro sterile (dimensione dei pori 0,2 μm), sigillare il coperchio con pellicola di paraffina e conservare a 4 °C.
    3. Utilizzando forbici a punta smussata (o tipo a forbice equivalente), tagliare la carta da filtro di cellulosa in rettangoli di circa 5 mm x 2,5 mm. Usa una matita per scrivere su un lato della carta da filtro per creare un'etichetta unica.
    4. Creare un reticolo o un motivo a scacchiera nella parte inferiore di una capsula di Petri di 35 x 10 mm usando un bisturi (lama n. 11, 40 mm).
    5. Accendere il liofilizzatore secondo le specifiche del produttore.
    6. Acquisire azoto liquido in un pallone Dewar o in un pallone sottovuoto isolante simile.
  2. Dissezione retinica
    1. Completare la dissezione retinica come descritto nella sezione 1 del protocollo (Figura 1A). Utilizzare la soluzione di Cold Ringer invece del buffer di Ames.
    2. Dopo la dissezione, conservare la retina rettangolare tagliata a metà in una capsula di Petri da 35 x 10 mm riempita con la soluzione fredda di Ringer e metterla sul ghiaccio.
  3. Preparazione del campione retinico per la liofilizzazione
    1. Posizionare un pezzo di carta da filtro da 5 x 2,5 mm e trasferire una retina dimezzata nella capsula di Petri texturizzata da 35 x 10 mm riempita con il tampone di Ringer freddo. Utilizzare una pipetta di trasferimento ad ampio foro per spostare ogni retina tra i piatti.
    2. Usa una pinzetta per capovolgere attentamente la retina in modo che sia orientata concava verso l'alto (i fotorecettori sono rivolti verso l'alto) e spostala in modo che riposi sopra la carta da filtro (Figura 2A).
      NOTA: Assicurarsi che i fotorecettori non contattino la carta da filtro (lo strato di cellule gangliari retiniche deve essere a diretto contatto con la carta da filtro) e che l'etichetta univoca sia visibile. Per identificare facilmente e rapidamente l'isolato retinico, si consiglia di posizionare l'etichetta univoca sul lato inferiore della carta da filtro.
    3. Sollevare la carta da filtro dai bordi verso l'alto in modo che il pezzo di retina dimezzato tocchi la carta da filtro e continuare a sollevare la carta da filtro dalla soluzione di Ringer.
    4. Posizionare il lato inferiore della carta da filtro (il lato senza la retina su di esso) su un tovagliolo di carta e tamponare con attenzione 2-3 volte per rimuovere il liquido in eccesso (Figura 2A).
    5. Raccogliere la carta da filtro con una pinzetta e aggiungere una goccia di Ringer freddo sul lato della carta da filtro con la retina. Posizionare nuovamente la carta da filtro sul tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Ripeti il processo altre due volte.
      NOTA: queste fasi alternate di bagnatura e asciugatura assicurano che il tessuto sia saldamente attaccato alla carta da filtro.
    6. Conservare ogni campione di retina/carta da filtro aderente in una capsula di Petri riempita con suonerie fredde fino al momento di congelare tutti i campioni. Ripeti questo processo per tutta la retina dimezzata.
    7. Ottenere una capsula di Petri di 35 x 10 mm pulita e asciutta (solo in basso) e un pezzo di foglio di alluminio tagliato in un quadrato da 3,5 x 3,5 pollici.
    8. Sollevare ogni campione dal buffer della suoneria fredda con una pinzetta. Assicurarsi che le pinzette contattino solo i bordi della carta da filtro, evitando la retina dimezzata.
    9. Posizionare il lato inferiore di ogni carta da filtro (il lato senza la retina su di esso) su un tovagliolo di carta e rimuovere il liquido in eccesso.
    10. Aggiungere una goccia di 1x PBS freddo (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) sul lato della carta da filtro in cui viene aderita la retina. Tamponare la carta da filtro sul tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso.
      NOTA: Assicurarsi che l'umidità della carta da filtro sia sufficientemente rimossa prima del congelamento.
    11. Posizionare tutti i pezzi di carta da filtro nella piastra di Petri da 35 x 10 mm. Utilizzare una carta velina priva di lanugine per allontanare il liquido in eccesso che circonda la carta da filtro.
      NOTA: Non sovraffollare la capsula di Petri con campioni. Se vengono utilizzati più di quattro occhi murini, prendere in considerazione l'utilizzo di una capsula di Petri più grande o di più piastre di Petri più piccole per contenere i campioni di retina / carta da filtro.
    12. Avvolgere strettamente l'intero piatto con un foglio di alluminio. Assicurarsi che i bordi del foglio di alluminio siano fissati e premuti senza intoppi sul fondo della capsula di Petri. Forare una manciata di fori da 0,1-0,2 mm nel coperchio del foglio di alluminio (Figura 2A).
    13. Usando pinze metalliche, abbassare gradualmente il foglio di alluminio coperto dalla capsula di Petri nell'azoto liquido. Conservare i campioni nell'azoto liquido (<10 min) fino al momento della liofilizzazione.
  4. Liofilizzazione
    1. Posizionare il foglio di alluminio coperto dalla capsula di Petri in un pallone di liofilizzazione e collegarlo alla macchina liofilizzatore seguendo il protocollo del produttore. Liofilizzare la retina per 30 min.
    2. Staccare il pallone dal liofilizzatore e spegnere la macchina secondo il produttore.
    3. Rimuovere il foglio di alluminio e lavorare con i campioni liofilizzati lo stesso giorno o conservarli in tubi microcentrifuga da 1 mL opportunamente etichettati. Collocare questi tubi in un contenitore (ad esempio un tubo conico da 50 ml) riempito con un essiccante anidro e conservare i campioni a -80 °C.
  5. Collezione di segmenti esterni e interni a stelo mediante peeling con nastro adesivo.
    1. Tagliare strisce di nastro adesivo trasparente (1-2 cm) e conservare le strisce sul bordo del distributore di nastro / banco da laboratorio / ecc. per un uso rapido.
    2. Spostare un campione retinico sul coperchio di una capsula di Petri di plastica 60 x 15 mm per il peeling. Assicurarsi di afferrare solo i bordi più esterni della carta da filtro ed evitare di toccare la retina.
    3. Usando forbici dell'iride a punta smussata (o un tipo di forbice equivalente), tagliare un piccolo pezzo rettangolare di nastro adesivo alle dimensioni approssimative del tessuto (1,5 x 2,5 mm).
    4. Posare con cura un piccolo pezzo di nastro adesivo sulla retina liofilizzata (Figura 2B) e applicare una leggera pressione con le pinzette per assicurarsi che si leghi con lo strato di fotorecettore (lo strato superiore arancione / rosa).
    5. Staccare lentamente il nastro. Sia il segmento esterno dell'asta (ROS) che il segmento interno dell'asta (RIS) saranno aderenti al nastro (Figura 2B).
    6. Assicurarsi che ci sia un sottile film bianco sulla superficie fratturata. Questo è RIS.To separare il RIS, posizionare un altro pezzo di nastro e spingere il nastro verso il basso sulla superficie fratturata (Figura 2B).
      NOTA: potrebbe essere necessario più di un pezzo di nastro adesivo per rimuovere l'intero sottile strato bianco.
    7. Posizionare il pezzo di nastro con solo lo strato arancione/rosa in un tubo microcentrifuga etichettato +ROS.
    8. Posizionare il nastro o i pezzi di nastro con il sottile strato bianco in un tubo microcentrifuga con l'etichetta +RIS.
      NOTA: Separare la retina liofilizzata con il nastro richiede pratica. La quantità di pressione applicata al nastro influenzerà il modo in cui il campione liofilizzato si fractionrà. Se viene esercitata troppa pressione sul nastro sopra il campione, l'intera retina liofilizzata si stacca dalla carta da filtro e si attacca al nastro. Se al nastro viene aggiunta troppa poca pressione, lo strato superiore arancione/rosa (+ROS) non si attaccherà al nastro.
    9. Raccogliere il tessuto retinico residuo (privo di strati ROS e RIS, -OIS) situato sulla carta da filtro staccando lo spesso strato bianco dalla carta da filtro con del nastro adesivo. Posizionare l'isolato in un tubo etichettato -OIS.
    10. Ripetere questi passaggi per ogni campione retinico dimezzato.
    11. Conservare gli strati isolati dalla retina liofilizzata a temperatura ambiente se si esegue la quantificazione proteica, l'elettroforesi su gel e gli immunoblot proteici lo stesso giorno, oppure conservare in un contenitore (come un tubo conico da 50 ml) riempito con essiccante anidro a -80 °C per un uso successivo.

3. Preparazione del campione Western blot per gli isolamenti di peeling

  1. Preparare il tampone di lisi RIPA
    1. In un flacone da 100 mL, aggiungere reagenti per ottenere una concentrazione finale di 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% desossicolato di sodio, 0,1% SDS e 1 mM EDTA. Aggiungere 100 ml di acqua ultrapura deionizzata e mescolare accuratamente.
      NOTA: il tampone di lisi RIPA può essere conservato a 2-8 °C per 2-3 settimane. Per una conservazione più lunga, aliquota e conservazione nel congelatore a -20 °C.
    2. Il giorno dell'esperimento, aggiungere un cocktail inibitore della proteasi (0,1 M PMSF, 1:1000 aprotinina e 1:1000 Leupeptin) al tampone di lisi RIPA e mantenere il ghiaccio.
  2. Preparazione lisato peeling della carta da filtro per western blot
    1. Assicurarsi che i tubi contenenti le bucce di carta da filtro e la retina pelata rimanente siano mantenuti sul ghiaccio (per l'esperimento lo stesso giorno) o rimossi dalla conservazione in congelatore a -80 °C e posti sul ghiaccio.
    2. Rimuovere il liquido in eccesso dal fondo dei tubi di microcentrifuga contenenti le bucce di carta da filtro. Ruotare rapidamente in una mini centrifuga per 2-4 s e scartare il liquido rimanente.
    3. Pipettare 45-55 μL di tampone RIPA freddo in tubi contenenti l'isolato di carta da filtro.
    4. Omogeneizzare ogni campione con un miscelatore di pestelli pulito e autoclavato per 1 minuto. Assicurarsi che la carta da filtro rimanga a contatto con il miscelatore di pestelli. Tenere la carta da filtro sul lato di ciascun tubo piuttosto che sul fondo.
    5. Con una pinzetta, spostare le carte da filtro sul lato di ciascun tubo e girare nella mini centrifuga per 2-4 s. Questo rimuoverà il buffer RIPA dalla carta da filtro.
    6. Rimuovere la carta da filtro essiccata e ripetere per tutte le carte da filtro all'interno di ciascun tubo, se necessario.
    7. Trasferire l'omogeneizzato in un nuovo tubo ed etichettarlo in modo appropriato.
      NOTA: questo è il passaggio più dispendioso in termini di tempo e, se non completato correttamente, gran parte del campione finirà per essere assorbito dalla carta da filtro.
    8. Pipettare 60-80 μL di tampone RIPA freddo nei singoli tubi con la retina pelata rimanente.
    9. Omogeneizzare ogni campione con un miscelatore di pestelli pulito e autoclavato per 1 minuto.
  3. Preparazione al lisato per peeling del nastro per western blot
    1. Posizionare i campioni liofilizzati RT o i campioni a -80 °C sul ghiaccio.
    2. Pipettare 50-70 μL di tampone RIPA freddo in ogni tubo contenente +ROS e +RIS peeling del nastro.
    3. Pipetta 60-80 μL di tampone di lisi fredda nei tubi -OIS contenenti la retina liofilizzata rimanente, con ROS e RIS rimossi.
    4. Omogeneizzare ogni campione con un miscelatore di pestelli pulito per 1 minuto. Assicurarsi che il nastro nei singoli tubi rimanga a contatto con il miscelatore di pestelli e il tampone di lisi.
    5. Con una pinzetta sterilizzata, spostare il nastro sul lato dei tubi e girare con una mini centrifuga per 2-4 s. Questo rimuoverà il liquido dal nastro. Rimuovere il nastro essiccato dai tubi.
      NOTA: A questo punto, è possibile combinare due isolati di mezza retina dalla stessa retina per il metodo di "peeling della carta da filtro" o "peeling del nastro" per assicurarsi di avere un volume sufficiente per eseguire un test dell'acido bicinchoninico (BCA).

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le attuali strategie sono state sviluppate per fornire metodi relativamente rapidi e semplici per isolare e analizzare le proteine tra specifici compartimenti subcellulari di bastoncelli per l'analisi western blot. Abbiamo applicato due tecniche di peeling sequenziale (Figura 1 e Figura 2) seguite da immunoblotting per dimostrare che questi metodi potrebbero essere utilizzati in modo affidabile per rilevare la distribuzione nota di transducina a bastoncello (GNA...

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Discussione

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Molte malattie della retina colpiscono le cellule dei fotorecettori dei bastoncelli, portando alla morte dei bastoncelli e, in definitiva, alla completa perdita della vista37. Una parte significativa delle origini genetiche e meccanicistiche della degenerazione retinica umana è stata ricapitolata con successo in numerosi modelli murini nel corso degli anni. In tale contesto, la capacità di separare facilmente e selettivamente i singoli compartimenti subcellulari dei bastoncelli dalla retina del pi...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da NIH Grant EY12155, EY027193 e EY027387 a JC. Siamo grati al Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) e Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) per la correzione del manoscritto. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) e il Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) per aver fornito l'attrezzatura necessaria per raccogliere i filmati forniti dall'autore. Materiale da: Kasey Rose et al, Separazione dei compartimenti cellulari dei fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine, Neurodegenerazione molecolare, pubblicato [2017], [Springer Nature].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Flacone da laboratorio o per terreni da 100 mL dotato di adattatore per tappo del tuboN/AN/A
100% O2 serbatoioN/AN/A
per flacone da 1000 ml, materiale filtrante in PES, 0,22 &; mGenesee Scientific25-235
4X SDS Sample BufferMillipore Sigma70607-3
50 mL Provetta FalconFisher Scientific14-432-22
95% O2 e 5% CO2serbatoio N/AN/A
Ames' Terreno con L-glutammina, senza bicarbonatoSigma-AldrichA1420
CaCl2 (99%, diidrato)SigmaC-3881
Drierite (solfato di calcio anidro, >98% CaSO4, >2% CoCl2)WA Hammond Drierite Co LTD21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polistirene, 35 x 10 mm)Falcon-Corning08-757-100A
Piatto per coltura tissutale Falcon Easy-Grip (60 x 15 mm)Falcon-Corning08-772F
Bisturi a piuma (n. 10, 40 mm)VWR100499-578
Bisturi a piuma (n. 11, 40 mm)VWT100499-580
KCl (99%)SigmaP-4504
Kimble Kontes pestello a pelletSigmaz359971
Labconco Fast-Freeze FlaskLabconco N/A
LN2 (azoto liquido) + Pallone Dewar o pallone sottovuoto simileN/AN/A
MgCl2SigmaM-9272
Milli-Q/acqua deionizzataEMD MilliporeN/A
Na2HPO4 (polvere)J.T. Baker4062-01
NaCl (cristallo)EMD MilliporeSx0420-3
NaHCO3Amresco0865
OmniPur EDTAEMD4005
OmniPur HEPES, acido liberoEMD5320
Parafilm MSigma-AldrichP7793
Reynolds Wrap Foglio di alluminioReynolds BrandsN/A
Scotch Magic Tape (12,7 mm x 32,9 m)Scotch-3MN/A
Sodio desossicolatoSigma-AldrichD67501
Spectrafuge mini centrifugaLabnet International, IncC1301
Camera di incubazione tissutale (acquistata o personalizzata)N/AN/A
Tris-HClJ.T.Baker4103-02
Triton X-100Signma-AldrichT8787
VirTis Benchtop 2K Liofilizzatore o macchina equivalenteSP ScientificN/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diametro 5,5 cm, dimensione dei pori 5 μ m)VWR28310-015
Carta da filtro qualitativa Whatman grado 1 (diametro 9 cm, dimensione dei pori 11 μ m)Whatman/GE Healthcare1001-090
Pipetta di trasferimento a foro largo, Global ScientificVWR76285-362
Filtro

Riferimenti

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