Questo protocollo presenta due tecniche per isolare i compartimenti subcellulari dei fotorecettori murini a bastoncello per l'analisi delle proteine. Il primo metodo utilizza retina viva e carta da filtro di cellulosa per separare i segmenti esterni dell'asta, mentre il secondo impiega retina liofilizzata e nastro adesivo per rimuovere gli strati del segmento interno ed esterno dell'asta.
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Articolo metodologico
Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine
In questo articolo
Sommario
Abstract
I fotorecettori a bastoncello sono neuroni sensoriali altamente polarizzati con compartimenti distinti. Le aste di topo sono lunghe (~80 μm) e sottili (~2 μm) e sono impacchettate lateralmente nello strato più esterno della retina, lo strato di fotorecettore, con conseguente allineamento di compartimenti subcellulari analoghi. Tradizionalmente, il sezionamento tangenziale della retina piatta congelata è stato utilizzato per studiare il movimento e la localizzazione delle proteine all'interno di diversi compartimenti del bastoncello. Tuttavia, l'elevata curvatura della retina del topo dominante rende difficile il sezionamento tangenziale. Motivati dallo studio del trasporto proteico tra compartimenti, abbiamo sviluppato due metodi di peeling che isolano in modo affidabile il segmento esterno dell'asta (ROS) e altri compartimenti subcellulari per le macchie occidentali. Le nostre tecniche relativamente rapide e semplici forniscono frazioni arricchite e subcellulari specifiche per misurare quantitativamente la distribuzione e la ridistribuzione di importanti proteine fotorecettrici in barre normali. Inoltre, queste tecniche di isolamento possono anche essere facilmente adattate per isolare e studiare quantitativamente la composizione proteica di altri strati cellulari all'interno della retina sia sana che degenerata.
Introduzione
Le cellule fotorecettrici a bastoncello, strettamente impacchettate nello strato più esterno della retina neurale, sono parte integrante della visione a luce fioca. Per funzionare come contatori di fotoni fedeli, le barre utilizzano una via di segnalazione basata sulla proteina G, chiamata fototrasduzione, per generare risposte rapide, amplificate e riproducibili alla cattura di singoli fotoni. Questa risposta alla luce alla fine innesca un cambiamento nella corrente sulla membrana plasmatica e viene successivamente segnalata al resto del sistema visivo1. Come suggerisce il nome, ogni cellula a bastoncello ha una forma distinta simile a un'asta....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida istituzionali locali del comitato per la cura degli animali da ricerca della University of Southern California (USC).
1. Metodo di peeling retinico a cellule vive
- Preparazione di tamponi di Ames, carte da peeling e piatto di dissezione
- Utilizzando forbici a punta smussata (o tipo a forbice equivalente), tagliare la carta da filtro in cellulosa (grado 413) in rettangoli di circa 5 mm x 2,5 mm. Conservare le talee per un uso futuro.
- Preparare 1 L di tampone HEPES di Ames combinando una bottiglia di Ames' Medium, 2,38 g di HEPES e 0,8....
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Risultati
Le attuali strategie sono state sviluppate per fornire metodi relativamente rapidi e semplici per isolare e analizzare le proteine tra specifici compartimenti subcellulari di bastoncelli per l'analisi western blot. Abbiamo applicato due tecniche di peeling sequenziale (Figura 1 e Figura 2) seguite da immunoblotting per dimostrare che questi metodi potrebbero essere utilizzati in modo affidabile per rilevare la distribuzione nota di transducina a bastoncello (GNA.......
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Discussione
Molte malattie della retina colpiscono le cellule dei fotorecettori dei bastoncelli, portando alla morte dei bastoncelli e, in definitiva, alla completa perdita della vista37. Una parte significativa delle origini genetiche e meccanicistiche della degenerazione retinica umana è stata ricapitolata con successo in numerosi modelli murini nel corso degli anni. In tale contesto, la capacità di separare facilmente e selettivamente i singoli compartimenti subcellulari dei bastoncelli dalla retina del pi.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH Grant EY12155, EY027193 e EY027387 a JC. Siamo grati al Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) e Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) per la correzione del manoscritto. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) e il Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) per aver fornito l'attrezzatura necessaria per raccogliere i filmati forniti dall'autore. Materiale da: Kasey Rose et al, Separazione dei compartimenti cellulari dei fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine, Neurodegenerazione molecolare, pubblicato [2017], [Springer Nature].
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Flacone da laboratorio o per terreni da 100 mL dotato di adattatore per tappo del tubo | N/A | N/A | |
| 100% O2 serbatoio | N/A | N/A | |
| per flacone da 1000 ml, materiale filtrante in PES, 0,22 &; m | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Provetta Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 e 5% CO2 | serbatoio N/A | N/A | |
| Ames' Terreno con L-glutammina, senza bicarbonato | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, diidrato) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (solfato di calcio anidro, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Dish (polistirene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Piatto per coltura tissutale Falcon Easy-Grip (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Bisturi a piuma (n. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Bisturi a piuma (n. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pestello a pellet | Sigma | z359971 | |
| Labconco Fast-Freeze Flask | Labconco N | /A | |
| LN2 (azoto liquido) + Pallone Dewar o pallone sottovuoto simile | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/acqua deionizzata | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (polvere) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (cristallo) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, acido libero | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Foglio di alluminio | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12,7 mm x 32,9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Sodio desossicolato | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifuga | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Camera di incubazione tissutale (acquistata o personalizzata) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K Liofilizzatore o macchina equivalente | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diametro 5,5 cm, dimensione dei pori 5 μ m) | VWR | 28310-015 | |
| Carta da filtro qualitativa Whatman grado 1 (diametro 9 cm, dimensione dei pori 11 μ m) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Pipetta di trasferimento a foro largo, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
Riferimenti
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Koch, K. W., Dell'Orco, D.
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Ristampe e permessi
