Articolo metodologico

Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità

DOI:

10.3791/62980

⸱

6 agosto 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology & Cell Biology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Department of Neurology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 4The Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and the Aging Brain; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per l'occlusione venosa retinica utilizzando il bengala rosa e un sistema di microscopio di imaging retinico guidato dal laser con raccomandazioni per massimizzare la sua riproducibilità in ceppi geneticamente modificati.

Abstract

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I modelli murini di occlusione venosa retinica (RVO) sono spesso utilizzati in oftalmologia per studiare il danno ipossico-ischemico nella retina neurale. In questo rapporto, viene fornito un metodo dettagliato che evidenzia i passaggi critici con raccomandazioni per l'ottimizzazione per ottenere tassi di occlusione costantemente efficaci in diversi ceppi di topi geneticamente modificati. Il modello murino RVO consiste principalmente nella somministrazione endovenosa di un colorante fotosensibilizzante seguito da fotocoagulazione laser utilizzando un microscopio di imaging retinico collegato a un laser a guida oftalmica. Tre variabili sono state identificate come determinanti della coerenza dell'occlusione. Regolando il tempo di attesa dopo la somministrazione del bengala rosa e bilanciando la linea di base e l'uscita laser sperimentale, la variabilità tra gli esperimenti può essere limitata e un tasso di successo più elevato di occlusioni raggiunto. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le malattie della retina caratterizzate da edema retinico e lesioni ipossico-ischemiche. Inoltre, poiché questo modello induce lesioni vascolari, può anche essere applicato per studiare la neurovascolarizzazione, la morte neuronale e l'infiammazione.

Introduzione

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L'occlusione venosa retinica (RVO) è una malattia vascolare retinica comune che ha colpito circa 28 milioni di persone in tutto il mondo nel 20151. La RVO porta al declino della vista e alla perdita negli adulti e negli anziani in età lavorativa, rappresentando una malattia pericolosa per la vista in corso che si stima aumenterà nel prossimo decennio. Alcune delle patologie distinte della RVO includono lesioni ipossico-ischemiche, edema retinico, infiammazione e perdita neuronale2. Attualmente, la prima linea di trattamento per questo disturbo è attraverso la somministrazione di inibitori del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Mentre il trattamento anti-VEGF ha contribuito a migliorare l'edema retinico, molti pazienti affrontano ancora un declino della vista3. Per comprendere ulteriormente la fisiopatologia di questa malattia e per testare potenziali nuove linee di trattamento, è necessario costituire un protocollo modello murino RVO funzionale e dettagliato per diversi ceppi murini.

I modelli murini sono stati sviluppati implementando lo stesso dispositivo laser utilizzato nei pazienti umani, abbinato a un sistema di imaging scalato alla dimensione corretta per un topo. Questo modello murino di RVO è stato segnalato per la prima volta nel 2007 4 e ulteriormente stabilito da Ebneter e altri 4,5. Alla fine, il modello è stato ottimizzato da Fuma et al. per replicare le manifestazioni cliniche chiave della RVO come l'edema retinico6. Da quando il modello è stato segnalato per la prima volta, molti studi lo hanno impiegato utilizzando la somministrazione di un colorante fotosensibilizzante seguito dalla fotocoagulazione delle principali vene retiniche con un laser. Tuttavia, la quantità e il tipo di colorante che viene somministrato, la potenza del laser e il tempo di esposizione variano significativamente tra gli studi che hanno utilizzato questo metodo. Queste differenze possono spesso portare a una maggiore variabilità nel modello, rendendolo difficile da replicare. Ad oggi, non ci sono studi pubblicati con dettagli specifici sulle potenziali strade per la sua ottimizzazione.

Questo rapporto presenta una metodologia dettagliata del modello murino RVO nel ceppo C57BL/6J e un ceppo knockout endoteliale inducibile da tamoxifene-9 knockout (iEC Casp9KO) con un background C57BL/6J e di rilevanza per la patologia RVO come ceppo di riferimento per un topo geneticamente modificato. Uno studio precedente aveva dimostrato che l'attivazione non apoptotica della caspasi-9 endoteliale istiga l'edema retinico e promuove la morte neuronale8. L'esperienza nell'uso di questo ceppo ha aiutato a determinare e fornire informazioni su potenziali modifiche per personalizzare il modello murino RVO, che può essere applicabile ad altri ceppi geneticamente modificati.

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Protocollo

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Questo protocollo segue la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. Gli esperimenti sui roditori sono stati approvati e monitorati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Columbia University.

NOTA: Tutti gli esperimenti hanno utilizzato topi maschi di due mesi che pesavano circa 20 g.

1. Preparazione e somministrazione di tamoxifene per l'ablazione genetica inducibile di geni floxati

NOTA: Il diametro dei vasi retinici può essere influenzato dal peso dell'animale. Assicurati che tutti gli animali utilizzati per un esperimento abbiano pesi simili.

  1. Diluire il tamoxifene in olio di mais ad una concentrazione di 20 mg/ml.
    NOTA: Il tamoxifene è un tossico ed è sensibile alla luce. Proteggere dalla luce, ad esempio, con un foglio di alluminio.
  2. Vortice la soluzione per un paio di secondi.
  3. Lasciare in forno a 55 °C per 15 min.
    NOTA: Assicurarsi che il tamoxifene si sia sciolto completamente. Potrebbe essere necessario un ulteriore vortice.
  4. Conservare la soluzione a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
  5. Utilizzare una siringa da 1 mL dotata di un ago da 26 G per l'iniezione di tamoxifene. Pulire l'area di iniezione con etanolo al 70%.  Somministrare 2 mg di tamoxifene (100 μL da 20 mg/ml) per via intraperitoneale (IP) una volta al giorno per il tempo stabilito secondo la specifica linea Cre inducibile.
  6. Concedere due giorni di riposo per gli animali prima di iniziare gli esperimenti.

2. Preparazione di reagenti per fotocoagulazione laser

  1. Rosa bengala
    NOTA: Il bengala rosa è sensibile alla luce. Conservare al buio fino all'uso e preparare fresco per ottenere i migliori risultati.
    1. Preparare il bengala rosa diluendolo a 5 mg/ml in soluzione salina sterile e filtrarlo attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm.
    2. Preparare una siringa da 1 mL dotata di un ago da 26 G con rosa bengala.
  2. Ketamina/xilazina
    1. Diluire ketamina e xilazina in soluzione salina sterile di conseguenza per le seguenti concentrazioni: ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg).
  3. Carprofen
    1. Diluire il carprofen a 1 mg/ml in soluzione salina sterile.
    2. Preparare una siringa da 1 mL dotata di un ago da 26 G con carprofene.
  4. Soluzione salina sterile
    1. Preparare una siringa da 5 mL dotata di un ago da 26 G con soluzione salina sterile.

3. Configurazione laser

  1. Maneggiare delicatamente il cavo in fibra ottica e collegarlo alla scatola di controllo laser e all'adattatore laser del microscopio di imaging retinico.
  2. Accendere la scatola della lampada del microscopio per imaging retinico.
  3. Accendere il computer e aprire il programma di imaging.
  4. Regolare il bilanciamento del bianco utilizzando un foglio di carta bianca e mettendolo davanti all'occhio del mouse e facendo clic su Regola nel programma di imaging.
  5. Accendere la scatola di controllo laser ruotando la chiave e seguendo le istruzioni sullo schermo della scatola di controllo laser.
    NOTA: Il laser utilizzato in questo esperimento è di classe 3B e può causare danni agli occhi. Indossare occhiali protettivi durante l'utilizzo del laser.
  6. Verificare la potenza laser di base.
    1. Utilizzare un misuratore di potenza laser.
    2. Regolare lo schermo della scatola di controllo laser sui seguenti parametri: 50 mW e 2.000 ms.
    3. Accendere il laser e posizionare il misuratore di potenza davanti all'oculare.
      NOTA: assicurarsi che la luce del microscopio sia spenta durante il test della potenza laser di base.
    4. Premere il pedale dell'interruttore a pedale per attivare il laser.
    5. Puntare alla lettura della potenza del laser di 13-15 mW.
      NOTA: La lettura della potenza laser determinerà la percentuale di successo per le occlusioni venose retiniche. Se la lettura della potenza del laser è troppo bassa, è possibile regolare la potenza e il tempo di esposizione del laser. Si veda la tabella 1 per le raccomandazioni.
  7. Regolare la potenza del laser sperimentale impostando lo schermo della scatola di controllo laser per i seguenti parametri: 100 mW, 1.000 ms.
  8. Spegnere il laser.
    NOTA: per sicurezza e per evitare il surriscaldamento, è meglio tenere il laser spento tra i mouse.

4. Iniezione della vena della coda di topo di rosa bengala

  1. Versare 300 ml di acqua in un becher da 500 ml.
  2. Riscaldare il becher in un forno a microonde per 1 minuto.
  3. Metti una garza nell'acqua calda nel becher.
  4. Metti il mouse in un sistema di ritenuta.
  5. Premere delicatamente la garza nella coda del topo e cercare le vene dilatate. Disinfettare il sito di iniezione usando una salvietta imbevuta di alcool dopo la dilatazione dell'acqua calda.
  6. Inserisca l'ago nel sito di iniezione e tiri la siringa per assicurarsi di essere nella vena. Quindi, iniettare la vena della coda del topo, somministrando la quantità corretta in base al peso dell'animale (37,5 mg / kg). Applicare pressione sul sito di iniezione per evitare ematoma o sanguinamento. Cancella il sito.
  7. Rilasciare il mouse dal sistema di ritenuta e riportarlo nella gabbia.
  8. Lasciare circolare 8 minuti affinché il bengala rosa circoli prima dell'iniezione di anestetici.
    NOTA: Questo fornirà un totale di 10 minuti tra l'iniezione di rose bengala e l'irradiazione laser.

5. Occlusione delle vene principali

  1. Accendere la piattaforma del mouse riscaldata.
  2. Aggiungere una goccia di fenilefrina e tropicamide in ciascun occhio.
  3. Iniettare 150 μL di anestetici, ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg) IP.
    NOTA: durante questa procedura, al mouse sono state somministrate due iniezioni IP. Quindi, i lati erano alternati. L'iniezione IP per l'anestesia è stata somministrata nel quadrante addominale inferiore destro e la soluzione salina è stata iniettata nel quadrante addominale inferiore sinistro. Si raccomanda di tirare la siringa prima dell'iniezione per assicurarsi che l'ago sia nell'addome e non negli organi.
  4. Pizzicare l'animale per determinare la profondità dell'anestesia e attendere fino a quando non risponde.
  5. Aggiungere una goccia di proparacaina cloridrato per occhio (analgesico).
  6. Aggiungi un unguento gel a entrambi gli occhi.
  7. Iniettare 150 μL di carprofen per via sottocutanea tra le orecchie.
  8. Posizionare il mouse sulla piattaforma.
  9. Regolare la piattaforma fino a quando la vista del fondo retinico è chiara e focalizzata.
  10. Conta le vene retiniche e scatta un'immagine del fondo.
    NOTA: Le vene retiniche sono più scure e più larghe delle arterie. Vene e arterie si alternano; Tuttavia, a volte può esserci un'arteria ramificata vicino al nervo ottico e, quindi, due arterie adiacenti.
  11. Accendere il laser e puntare verso una vena retinica a circa 375 μm dal disco ottico.
  12. Irradiare il recipiente premendo l'interruttore a pedale e spostando leggermente il raggio laser fino a 100 μm. Ripetere questo passaggio tre volte e spostare il raggio laser dopo ogni impulso in modo che l'irradiazione non sia focalizzata in un punto.
  13. Ripetere l'irradiazione su altri vasi principali per ottenere 2-3 occlusioni.

6. Stabilire il numero di vene occluse al giorno 0

  1. Spegnere la lampada dopo aver irradiato i recipienti e attendere 10 minuti.
    NOTA: L'esposizione alla luce può causare danni alla retina e infiammazione; Spegnere la lampada durante il tempo di attesa per ridurre al minimo l'esposizione7.
  2. Riaccendere la lampada e contare il numero di vene occluse.
  3. Prendi un'immagine del fondo.

7. Assistenza post-vendita

  1. Iniettare 1 mL di IP salino sterile.
    NOTA: vedere i dettagli dell'iniezione IP nel paragrafo 5, punto 3.
  2. Aggiungere colliri lubrificanti su entrambi gli occhi.
  3. Aggiungi un unguento gel a entrambi gli occhi.
  4. Guarda il topo mentre si riprende dall'anestesia e non restituirlo alla gabbia con gli altri animali fino a quando non si è completamente ristabilito. Carprofen (5 mg/kg) può essere somministrato giornalmente fino a 2 giorni dopo la procedura. Se applicato agli esseri umani, il dolore non è un sintomo di RVO.
    NOTA: Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando non si riprendono completamente dall'anestesia.

8. Valutazione dell'edema retinico mediante tomografia a coerenza ottica (OCT)

NOTA: questo passaggio può essere eseguito nel punto di interesse dello sperimentatore. Il picco di edema retinico per un topo C57BL / 6J è 1 giorno dopo la procedura RVO. Questo punto temporale può variare a seconda dello sfondo del mouse.

  1. Accendere la scatola luminosa del microscopio per imaging retinico, la macchina OCT e la piattaforma del mouse riscaldata.
  2. Il giorno dopo l'occlusione, seguire i passaggi da 5.2 a 5.7 per preparare l'animale.
  3. Aprire i programmi software di imaging e dello Strumento di personalizzazione di Office.
  4. Nel programma dello Strumento di personalizzazione di Office regolare la spinta su 5.
  5. Prendi OCT a 75 μm distali dalla bruciatura o 4 clic.
  6. Prendere immagini OCT in quattro quadranti della retina.
  7. Analizzare le immagini dello Strumento di personalizzazione di Office utilizzando il software di tracciamento.
  8. Confrontare lo spessore retinico delle misure pre-irradiate con 1 giorno dopo RVO o nel punto di interesse temporale.
    NOTA: Quando si analizzano i dati, prendere in considerazione il numero di vene irradiate in quanto ciò può influenzare lo sviluppo di edema retinico. Gli animali vengono quindi eutanizzati somministrando anestetico seguito da un intervento chirurgico di perfusione non di sopravvivenza.

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Risultati

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Il modello murino RVO mira a raggiungere con successo occlusioni nelle vene retiniche, portando a lesioni ipossico-ischemiche, rottura della barriera retinica del sangue, morte neuronale ed edema retinico8. La Figura 1 mostra una sequenza temporale dei passaggi per garantire la riproducibilità, uno schema del progetto sperimentale e delinea i passaggi che possono essere ulteriormente ottimizzati a seconda delle domande sperimentali. I tre passaggi principali che posso...

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Discussione

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Il modello RVO murino fornisce una strada per comprendere ulteriormente la patologia RVO e per testare potenziali terapie. Mentre il modello RVO del mouse è ampiamente utilizzato sul campo, vi è la necessità di un protocollo dettagliato corrente del modello che affronti la sua variabilità e descriva l'ottimizzazione del modello. Qui, forniamo una guida con esempi dall'esperienza su ciò che può essere modificato per ottenere i risultati più coerenti in una coorte di animali da esperimento e fornire dati affidabili.

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (al CCO), dal National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (all'AMP) e dal National Institute on Aging (NIA) R21AG063012 (al CMT).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CarprofeneRimadylNADA #141-199mantenere a 4 gradi C
Olio di maisSigma-AldrichC8267
Cavo patch in fibraThor LabsM14L02
GenTealAlcon00658 06401
Ketamina cloridratoHenry ScheinNDC: 11695-0702-1
Lasercheckcoerente1098293
fenilefrinaAkornNDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV con meridiano,  StreamPix e moduli OCTPhoenix Technology Group
Proparacaina cloridratoAkornNDC: 17478-263-12mantenere a 4 gradi C
AggiornaAllergan94170
Rose BengalSigma-Aldrich330000-5G
TamoxifeneSigma-AldrichT5648-5GTropicamide sensibile alla luce
AkornNDC: 174478-102-12
XilazinaAkornNDCL 59399-110-20

Riferimenti

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