Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo avanzato per sintetizzare alte rese di proteine ricombinanti da un sistema di trascrizione senza cellule streptomyces venezuelae (TX-TL).
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Articolo metodologico
Un toolkit di trascrizione-traduzione di streptomyces ad alto rendimento per la biologia sintetica e le applicazioni dei prodotti naturali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Streptomyces spp. sono una delle principali fonti di antibiotici clinici e prodotti chimici industriali. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 è una varietà in rapida crescita e un produttore naturale di cloramfenicolo, jadomicina e pikromicina, il che lo rende un candidato attraente come telaio di biologia sintetica di prossima generazione. Pertanto, gli strumenti genetici che accelerano lo sviluppo di S. venezuelae ATCC 10712, così come altri modelli di Streptomyces spp., sono altamente desiderabili per l'ingegneria e la scoperta di prodotti naturali. A tal fine, in questo protocollo viene fornito un sistema S . venezuelae ATCC 10712 privo di cellule dedicato per consentire l'espressione eterologa ad alto rendimento di geni ad alto G + C (%). Questo protocollo è adatto per reazioni batch su piccola scala (10-100 μL) in formato piastra a 96 pozzetti o 384 pozzetti, mentre le reazioni sono potenzialmente scalabili. Il sistema privo di cellule è robusto e può raggiungere rese elevate (~ 5-10 μ M) per una gamma di proteine ricombinanti in una configurazione minima. Questo lavoro incorpora anche un ampio set di strumenti plasmidici per la misurazione in tempo reale dell'mRNA e della sintesi proteica, nonché la colorazione a fluorescenza in gel delle proteine marcate. Questo protocollo può anche essere integrato con flussi di lavoro di caratterizzazione dell'espressione genica ad alto rendimento o con lo studio di percorsi enzimatici da geni ad alto G + C (%) presenti nei genomi di Actinomiceti.
Introduzione
I sistemi di trascrizione-traduzione senza cellule (TX-TL) forniscono una piattaforma di prototipazione ideale per la biologia sintetica per implementare cicli rapidi di progettazione-costruzione-test-apprendimento, il framework di ingegneria concettuale per la biologia sintetica1. Inoltre, vi è un crescente interesse per i sistemi TX-TL per la produzione di proteine ricombinanti di alto valore in un ambiente a reazione aperta2, ad esempio, per incorporare amminoacidi non standard nei coniugati anticorpo-farmaco3. In particolare, TX-TL richiede un estratto cellulare, plasmide o DNA lineare e una s....
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Protocollo
NOTA: vedere la Tabella 1 e la Tabella 2 per le ricette per GYM medium e piastra di agar e tamponi di lavaggio S30A e S30B.
1. Preparazione di soluzioni e linee guida generali
- Mantenere tutte le soluzioni, le cellule (post-crescita) e gli estratti cellulari sul ghiaccio dopo la preparazione, a meno che non venga indicata un'eccezione.
- Conservare le scorte per 1 M Mg-glutammato, 4 M K-glutammato, 40% (p/v) PEG 6000, 1 g/mL di acido polivinilsolfonico a temperatura ambiente e tutti gli altri stock a -80 °C. Ridurre al minimo il numero di cicli di congelamento-scongelamento per evitare la ....
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Risultati
Questo protocollo dettagliato viene fornito come esempio per aiutare l'utente a stabilire un sistema Streptomyces TX-TL basato sul ceppo modello S. venezuelae ATCC 10712 (Figura 1). L'utente può cercare di studiare altri ceppi di Streptomyces; tuttavia, le fasi di crescita/raccolta di altri ceppi con tempi di raddoppio più lunghi o preferenze di crescita distinte dovranno essere ottimizzate su misura per ottenere risultati ottimali. Per il risultato rappresentativo.......
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Discussione
In questo manoscritto, è stato descritto un protocollo S. venezuelae TX-TL ad alto rendimento con passaggi dettagliati che sono semplici da condurre sia per gli utenti esperti che per quelli nuovi dei sistemi TX-TL. Diverse caratteristiche dei protocolli Streptomyces45 ed E. coli TX-TL41 esistenti sono state rimosse per stabilire un protocollo minimo, ma ad alto rendimento per S. venezuelae TX-TL5,26.
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano riconoscere il seguente supporto alla ricerca: EPSRC [EP/K038648/1] per SJM come PDRA con PSF; Wellcome Trust ha sponsorizzato la borsa di studio ISSF per SJM con PSF presso l'Imperial College di Londra; Borsa di ricerca della Royal Society [RGS\R1\191186]; Premio Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] per SJM presso l'Università del Kent; e Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. borsa di studio per KC presso l'Università del Kent.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pallone UltraYield da 2,5 L | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| Piastra inferiore a 384 pozzetti nero/trasparente | ThermoFisher | 10692202 | |
| Cloruro di ammonio (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (soluzione 100 mM, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillina (contattare il fornitore per la purezza) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucosio (contattare il fornitore per la purezza) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥ 98% - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contattare il fornitore per la purezza) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contattare il fornitore per la purezza) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucosio-6-fosfato (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contattare il fornitore per la purezza) | Melford | B2001 | |
| Acido L-glutammico, sale di emimagnesio, tetraidrato (>98%) | Sigma | 49605 | |
| cloruro di magnesio (98%) | Fluorochem, | 494356 | |
| estratto di malto | Sigma | 70167-500G | |
| , PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce, piastra per microdialisi a 96 pozzetti, 10K MWCO, | ThermoFisher | 88260 | |
| poli(vinile) sale di potassio | Sigma | 271969 | |
| Glutammato di potassio (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS campionatore di aminoacidi | 5 Prime | 2401530 | |
| Cloruro di sodio (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 colonna SPE (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Estratto di lievito | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
Riferimenti
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis.
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Ristampe e permessi
